ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Сшивание субъединиц бифункциональными реагентами из "Практическая химия белка" При определении числа мономеров з олигомере все большее распространение получает метод, основанный на сшивании мономеров бифункциональными реагентами с последующим анализом продуктов реакции с помощью электрофореза в ПААГ — ДСН [44]. Электрофореграмма представляет собой набор зон, соответствующих компонентам смеси, молекулярные массы которых кратны молекулярной массе мономера вплоть до полного олигомера. В случае олигомеров, составленных из идентичных или почти идентичных мономеров, число основных зон должно соответствовать набору мономеров. [c.52] С помощью бифункциональных реагентов можно определять четвертичную структуру олигомеров [72, 82], однако этот вопрос требует специального обсуждения. Тем не менее, когда речь идет о простой системе —тетрамере, гексамере или октамере,— имеет смысл использовать такой подход для определения расположения мономеров в олигомере. [c.52] Бисиминоэфиры гидролизуются в растворе по двум или одной функциональной группе, тогда как другая может быть связана с аминогруппой белка. Некоторые молекулы реагента взаимодействуют с двумя молекулами белка, образуя как внутри-, 1ак и межмолекулярные ковалентные связи [132]. [c.53] На молекулярную массу конечного продукта существенное влияние оказывают только межмолекулярные связи, что легко обнаружить в денатурирующих условиях. Поперечные связи в пределах субъединиц (аналогично дисульфидным связям) удерживают полипептидную цепь в свернутом состоянии, уменьшая тем самым гидродинамический объем и кажущуюся молекулярную массу. Некоторые из продуктов, полученных при сшивании тетрамеров типа 4 и а2 2, представлены на рис. 1.6. Распределение полимеров по молекулярным массам определяется числом и положением поперечных связей. [c.53] Тем не менее по спектру молекулярных масс перекрывающихся полимеров можно определить число мономеров в простом олигомере. Олигомеры, составленные из мономеров с различными молекулярными массами (например, типа 2 2), образуют более сложный набор полимеров, и интерпретация полученных результатов бывает затруднительна. [c.53] При работе с одним реагентом можно прийти к неоднозначным или даже ошибочным выводам. Лучше всего проводить исследования с несколькими реагентами — членами одного гомологического ряда. [c.55] Концентрация бифункционального реагента. От концентрации пнфункционального реагента непосредственным образом зави-С1 т степень сшивки олигомера, иными словами, чем выше концентрация, тем выше степень сшивки. Однако отмечено [132], чго избыток сшивающего реагента по отношению к количеству (хтнгомера не оказывает существенного влияния на скорость реакции, а чрезмерный избыток, по-видимому, вызывает протекание нежелательных побочных реакций. Если, увеличивая концентрацию реагента, не удается повысить степень сшивки олигомера до желаемого значения, это может свидетельствовать о преимущественном образовании внутримолекулярных поперечных связей. [c.55] Концентрация белка. Во избежание полимеризации олигомеров концентрация белка в реакционной смеси должна быть низкой. Если известна молекулярная масса олигомера, то признаком образования межмолекулярных (между молекулами олигомера) связей будет присутствие в смеси компонентов с молекулярной массой, превышающей М олигомера. Воспрепятствовать образованию поперечных связей (сшивок) олигомеров можно с помощью предварительной иммобилизации белка на нерастворимой матрице [135], например благодаря образованию дисульфидной связи с тиольными группами сефарозы 4В (разд. 3.2.5) далее можно провести обработку бисиминоэфира-ми [32]. [c.55] Растворяют 0,5 г нитрила пробковой кислоты в смеси 2 мл метанола (высушенного с помощью молекулярного сита) и 15 мл этилового эфира при ОХ. Через раствор в течение 30 мии пропускают сухой НС1 и выдерживают реакционную смесь при 4°С в течение 24 ч. Прибавляют 10 мл сухого диэтилового эфира, выпавшие кристаллы тщательно промывают сухой смесью метанол —эфир (1 3) без доступа влаги. Полученный гидрохлорид бисиминоэфира (выход 0,81 г, 81%) используется без дополнительной перекристаллизации. [c.55] Спустя три часа избыток реагента полностью гидролизуется. При определении кинетики реакции отбирают аликвотные пробы, а реакцию прерывают, добавляя двукратный избыток (по отношению к реагенту) гидроксиламина. [c.56] Электрофорез в ПААГ — ДСН, Продукты реакции исследуют с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН (разд. 1.3.1.1) или с помощью гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в присутствии денатурирующих агентов. Поскольку, по всей вероятности, поперечно-сшитые продукты будут иметь 100 ООО, готовят 5%-ный гель, а образец наносят в количестве 50 мкг. В случае простых олигомеров, содержащих идентичные или почти идентичные мономеры, состав определяют по количеству основных зон. Если степень сшивки невелика, молекулярные массы гибридных молекул, кратные молекулярной массе мономера, можно найти по градуировочному графику. Высокое содержание поперечных связей может быть причиной аномального поведения полимеров при электрофорезе. [c.56] Если концентрация белка в образце достаточно высока, пробу наносят (в случае использования ступенчатой системы) без предварительного диализа. Возможно, что образец будет необходимо сконцентрировать, лучше всего это сделать путем осаждения трихлороуксусной кислотой. Осадок растворяют в буфере для образца (раздел 1.3.1.1). [c.56] На диссоциацию и сборку олигомерного белка может оказывать влияние pH среды, и этот фактор может быть причиной получения недостаточно четких данных. Замечено [171], что в некоторых случаях конформация мономера может в такой стспе1ш зависеть от pH среды, что реакция со сшивающими агентами вообще не идет. [c.57] Область применения метода ограничена олигомерами с молекулярной массой не более 500 000, поскольку эта величина является верхним пределом разрешения с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН. [c.57] Вернуться к основной статье