ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез в полиакриламидном геле из "Практическая химия белка" Третичная и четвертичная структуры олигомеров нарушаются в присутствии мочевины, гуанидиигидрохлорида и ДНС (разд. [c.58] Идентифицируя продукты диссоциации, можно определить соотношение мономеров в олигомере. Существенное значение может иметь pH среды. Например, агглютинин проростков пшеницы и его сукцинилпроизводное при рН 5 — димеры, но диссоциируют при рН 5, [122]. Зависимость четвертичной структуры от pH определяет условия сборки и реконструкции белка. Гемоцианин, агрегат из 8 гексамеров, диссоциирует на мономеры и димеры при pH 8,9 (в присутствии ЭДТА для связывания Са2+). Напротив, при изменении ионной силы, pH и концентрации Са + гемоцианин диссоциирует с образованием комплексов гексамера промежуточного размера [20]. [c.59] Для отдельных олигомеров существенное значение могут иметь параметры среды, например величина pH, После диссоциации фумаразы в мочевине [186] и диализа против воды не происходит сборки активного тетрамера, однако реконструкция удается при диализе против буфера в отсутствие мочевины (разд. 1.4,4.1). Первоначально образующийся продукт обладает частичной активностью и является в основном димером, хотя данные флуоресценции и кругового дихроизма совпадают с соответствующими параметрами нативного тетрамера. [c.59] Затем раствор диализуют иротив исходного буфера, но не содержащего мочевину, при 4 С в течение 24 ч, а затем инкубируют при 25 С в течение 3 ч. [c.60] О °С в течение 30 мин, а затем диализуют против 100 мМ трис-НС1 буфера (pH 8,0), содержащего 1 мМ дитиотреит. Для обессоливания используют гель-фильтрацию на сефадексе 0=50. [c.60] Если олигомер включает два и более различных типов мономеров (или полипептидных цепей), которые могут быть разделены электрофорезом в ПААГ, то стехиометрическое содержание субъединиц можно определить денситометрией или с помощью введения радиоактивной метки. Предварительно субъединицы выделяют в очищенном состоянии и определяют в молекуле содержание остатков меченых аминокислот в случае денситометрии строят градуировочные графики связывания красителя. [c.60] Введение радиоактивной метки. Методика алкилирования остатков цпс-теина иодоуксусной кислотой описана в разд. 2.2.1 Л. Меченая [ С]иодо-уксусная кислота может быть разбавлена немеченым реагентом. [c.61] Измерение радиоактивности [16]. По завершении электрофореза белковые зоны проявляют (окрашивают), вырезают, помещают в пластмассовые пробирки для измерения скорости счета и высушивают в вакууме. Высушенный гель выдерживают в 0,3 мл ЗО о НОго Н2О2, содержащего 1 % ЫН40Н, при 60 С в течение б ч до полного растворения. В контрольных опытах было показано, что при этом не происходит потери метки. Добавляют сцинтиллятор 3,0 мл смеси толуол — тритон 2 1)], содержащий 2,5-дифенилоксазол (5 г/л), и измеряют скорость счета. В качестве внешнего стандарта используется Ва. Эффективность счета составляет обычно 70—75%. Для определения фона используют кусочки геля без метки, обработанного аналогичным образом. [c.62] Вернуться к основной статье