ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Получение мономеров с целью секвенирования из "Практическая химия белка" Восстановление сульфоксида S-карбокси метил цистеина в г ентидах и белках проводят в те же условиях, однако время реакции увеличивают в 5 раз. [c.73] Для отщепления олигосахаридных фрагментов гликопротеинов можно использовать продажный раствор HF в пиридине (реакцию проводят при комнатной температуре в течение 90 мин). [c.74] Однако этот реагент не всегда действует столь эффективно, как безводный HF, который расщепляет гликозидные связи нейтральных и кислых сахаров при 0°С в течение 1 ч [124]. К сожалению, при такой обработке изменяются физические свойства белка, хотя образец может быть вполне пригоден для секвенирования. [c.75] Обычно мономер или полипептидные цепи обессоливают с помощью диализа или гель-фильтрации. Значение операции обессоливания не следует недооценивать. Иногда, прежде чем вести диализ против воды, образец целесообразно диализовать против разбавленных электролитов или буферных растворов. В этом случае образец сохранит растворимость в воде после исчерпывающего обессоливания. Для диализа в небольшом объеме выпускаются специальные ячейки. [c.75] Крупные пептиды и белки трижды диализуют в течение 12 ч против 0,15 М Na l, содержаш,его 0,1% ДСН, а затем трижды против 0,027о ДСН. Если белок был выделен методом электрофореза в ПААГ — ДСН, элюат центрифугируют при 20 000 об./мин в течение 20 мин для удаления частиц акриламидного геля. Примеси красителя кумасси не мешают секвенированию. Однако следует помнить, что равновесное распределение ДСН через диализную мембрану — процесс медленный и может потребовать нескольких дней. Таким образом, окончательная концентрация ДСН в образце зависит от продолжительности диализа. [c.76] Как правило, первичную структуру белка не удается установить путем последовательного секвенирования всей полипептидной цепи. Для этого приходится анализировать фрагменты, полученные избирательным расщеплением полипептидной цепи химическим или ферментативным методом. Следователыю, стадия фрагментации полипептидной цепи па низкомолекулярные пептиды с целью последующего структурного анализа — это один из важнейших этапов в определении ковалентно (первичной) структуры белка. [c.82] В этой главе рассматриваются способы фрагментации ноли-пептидных цепей химическими методами вопросам ферментативного гидролиза посвящены гл. 3 и 10. [c.82] Потребность в методиках получения крупных фрагментов стимулирует все больший интерес к развитию специфических методов расщепления. В настоящей главе обсуждаются главным образом те методы, которые проверены на практике и нашли практическое применение. Наряду с хорошо известными методами расщепления по метионину, триптофану, тирозину и цистеипу в данной главе рассматриваются также частичный кислотный гидролиз и восстановительное и окислительное расщепление по остаткам цистина. Литература по химической фрагментации пептидов и белков хорошо известна, поэтому авторы не ставили перед собой задачу охватить все аспекты проблемы. Читатель, проявляющий более глубокий интерес к этой тематике, может найти разнообразную информацию в обстоятельных обзорах [4, 74, 78, 81, 83, 181, 209]. [c.83] Остатки цистина могут образовывать как внутри-, так и межцепочечные связи. Поэтому при секвенировании обязательным этапом является расщепление дисульфидных связей в первую очередь с целью разделения полипептидных цепей. В то же время дисульфидные связи имеют высокую реакционную способность, и это обстоятельство может вызвать осложнение при структурном анализе. Поэтому при расщеплении 5—5-групп остатки цистеина необходимо перевести в стабильные производные. Наконец, после восстановления остатков цистеина белки становятся более доступными действию протеолитических ферментов. Способы расщепления дисульфидных связей рассматриваются в гл. 4. По этому вопросу имеется также ряд обзоров [26, 59, 98, 116]. В настоящую главу включены только те методики, которые нашли практическое применение. [c.83] При этом избыток восстановителя в расчете па S—S-группы составил 5—20%. В щелочной среде реакция идет с высокой скоростью, избирательно, почти количественно. Алкилирование образующихся SH-rpynn можно вести в присутствии восстановителя. В кислой среде реакция идет с низкой скоростью (время реакции 24—48 ч). Гомогенность среды создают добавлением 1-пропанола (до соотношения 1 1), что дополнительно способствует солюбилизации белка. Трибутилфосфин токсичен п имеет неприятный запах, работать с ним необходимо в вытяжном шкафу. Реагент и приготовлеш ые растворы рекомендуется хранить под азотом, 2%-ный (об./об.) раствор в пропаполе имеет восстановительный эквивалент 55—70 мкмоль/мл. [c.86] Вернуться к основной статье