ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Изучение микроорганизмов в световом микроскопе из "Руководство к практическим занятиям по микробиологии Изд.3" Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов. [c.101] Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с помощью окулярной линейки — микрометра или окулярного винтового микрометра. Для измерения лучще использовать живые, а не фиксированные клетки, так как фиксация и окраска клеток приводят к некоторому изменению их истинных размеров. Удобно определять размеры клетки, пользуясь фазово-контрастным устройством. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного раствора агара. Размеры клеток выражают в микрометрах (мкм). [c.102] Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в окуляр. Для этого вывинчивают глазную линзу окуляра, помещают на его диафрагму окулярный микрометр делениями вниз и завинчивают линзу. Однако делениями окуляр-мнкрометра нельзя непосредственно измерить величину клетки, так как последние рассматриваются через объектив и окуляр, а деления линейки — только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного увеличения микроскопа, что делают с помощью объективного микрометра. [c.102] Для этого определяют, какому числу делений окулярной линейки соответствует величина измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра. [c.103] Удобно определять размеры клеток с помощью винтового окулярного микрометра МОВ-1-15. Винтовой окулярный микрометр закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр. В окуляре винтового микрометра имеется неподвижная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрестием. Пластинка связана с микрометрическим винтом-барабаном и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки вращением микрометрического винта-барабана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления барабана при данном увеличении микроскопа. [c.103] Цену деления барабана для каждого объктива определяют с помощью объективного микрометра. С этой целью подводят перекрестие к началу одного деления объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует 1 деление объективного микрометра. Например, 1 деление объективного микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X делениям микрометрического винта-барабана, следовательно, 1 деление его при данном увеличении микроскопа равно 10 Х мкм. [c.103] Чтобы результаты были достоверными, необходимо измерить не менее 20—30 клеток. При определении размеров округлых форм измеряют диаметр клеток, у других форм — длину и ширину, указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т. е. минимальные и максимальные размеры. [c.103] Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем — капсулой или слизью. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании ивых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются,, а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. Чаще всего для выявления капсул применяют способ негативной окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплк разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40Х- На общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы,, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет. Кроме того, существуют специальные методы окраски капсул, один из них приведен ниже. [c.104] Окраска капсул по методу Гинса. На конец предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок до всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5—10 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1 3. Время окрашивания — 2—3 мин. Препарат промывают водой, высущивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастна выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами. [c.104] Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощью которой удается легко выявить границы между отдельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-ным раствором фосфоромолибденовой кислоты. Затем препарат промывают водой, и окрашивают не более 15 с 0,02%-ным раствором кристаллвио-лета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в черный, а цитоплазма — в бледно-сиреневый цвет. [c.104] Окраска по Граму. С молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки связывают способность бактерий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями, триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом, при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином или сафранином они приобретают розовую окраску. [c.105] Как правило, по Граму окрашивают клетки молодых, чаще всего суточных, культур, так как способность удерживать краситель зависит от физиологического состояния бактерий. Например, некоторые бактерии после прекращения активного роста теряют способность окрашиваться по Граму. [c.105] Жгутики. Способность к движению у большинства микроорганизмов обусловлена наличием жгутиков. Расположение и количество их у различных бактерий варьируется и имеет диагностическое значение. Особенно важен этот признак для идентификации палочковидных грамотрицательных бактерий. По характеру движения бактерий в препарате можно предположительно судить о типе жгутикования. Если жгутики расположены на одном или на двух полюсах клетки, то движение обычно очень быстрое — ввинчивающееся , без покачивания из стороны в сторону при латеральном или перитрихиальном расположении жгутиков клетки двигаются плавно, совершая колебательные отклонения от оси движения. [c.106] Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает кажущуюся толщину жгутика. Так, диаметр отдельных жгутиков колеблется в пределах 0,01 — 0,02 мкм (у Bdellovibrio 0,04—0,06 мкм), а максимальное разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Лишь у немногих бактерий, например у представителей рода Spirillum, пучки жгутиков достаточно плотны и их удается обнаружить при наблюдении в светлом поле с помощью фазово-контрастного устройства или в темном поле. [c.106] НОСТИ в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании суспензии. [c.107] Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пешкова. Бактерии, предназначенные для окраски жгутиков, ежедневно в течение 2—3 дней пересевают в свежую жидкую или на плотную среду, содержащую не более 1,5% агара. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-часовой культуры Клетки осторожно берут петлей и переносят в пробирку со стерильной водой, подогретой до температуры, при которой их выращивали. Прежде чем делать мазок, каплю полученной суспензии просматривают под микроскопом и убеждаются в том, что клетки подвижны и плотность суспензии невелика — 5—10 клеток в поле зрения. [c.107] Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка, поэтому необходимо обращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения на него суспензии. Предметные стекла должны быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовлением мазка стекло 3—4 раза проводят через наиболее горячую часть пламени горелки. Дают стеклу остыть и пастеровской пипеткой или петлей наносят 3—4 маленькие капли на стекло. Капли должны хорощо расплываться по стеклу и быстро высыхать. Высушенный мазок заливают протравой. Необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала. Через 15 мин протраву смывают дистиллированной водой и препарат окрашивают в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раствор красителя. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой. Обращают внимание на расположение жгутиков, их количество и длину. [c.107] Вернуться к основной статье