ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Поглощение белков в ближней УФ-области обусловлено ароматическими аминокислотами из "Биофизическая химия Т.2" Изменение pH мало влияет на спектры поглощения изолированных пептидных хромофоров. В противоположность этому тирозин и триптофан весьма чувствительны к pH, так как места протонирования этих молекул непосредственно связаны с системой электронного сопряжения хромофоров. Наиболее ярко это проявляется в спектральном сдвиге у тирозина, когда отщепляется протон ОН-группы (рЛТ 10,9) (см. рис. 7.11). Этот сдвиг можно весьма точно зарегистрировать, просто измеряя поглощение при 295 нм. Снимая разностные спектры при этой длине волны, можно с высокой точностью следить за титрованием остатков тирозина в белках. Влияние pH на поглощение триптофана не столь существенно, чтобы использовать его для аналогичных измерений. К тому же значения рКд триптофана лежат вне области значений pH, при которых большинство белков сохраняет свою нативность. [c.35] Наличие в том или ином белке простетической группы создает те же проблемы, что и присутствие ароматических аминокислот. Например, гемы, флавины, пиридоксальфос-фат и некоторые металлопротеиды обладают интенсивными полосами поглощения в ближней УФ- и видимой областях. По этим полосам, обычно весьма чувствительным к ближайшему окружению простетических групп, можно с успехом следить за их состоянием, например за окислением или оксигенацией. При исследовании многих ферментативных процессов физическими методами наличие таких удобно расположенных хромофоров подчас оказывается просто необходимым. [c.36] Наличие простетической группы оказывается полезным лишь при условии, что она обладает достаточно большим коэффициентом молярной экстинкции, дабы быть заметной при типичных концентрациях белка. Последние во избежание агрегации должны быть меньше 2,5 мг мл Если простетические группы обладают = 10 — Ю , тотем самым обеспечивается более чем достаточная экспериментальная чувствительность в широком диапазоне концентраций. В табл. 7.2 кратко суммированы спектральные свойства некоторых белков, содержащих наиболее распространенные простетические группы. [c.37] Интенсивное поглощение всех нуклеиновых кислот в ближней УФ-области почти целиком обязано пуриновым и пиримидиновым основаниям. Сахарофосфатный остов РНК и ДНК дает незначительный вклад в спектр поглощения при длинах волн, превышающих 200 нм. Несмотря на это свободные основания не могут служить совершенными моделями хромофоров нуклеиновых кислот. Отсутствие гликозидной С—N-связи вызывает значительное возмущение электронных состояний. Например, свободные пурины могут претерпевать таутомерные превращения вследствие перемещения протона между атомами азота в положениях 9 и 7. Более приемлемыми модельными соединениями являются -метилпурины и N -метилпиримидины. Спектры этих веществ весьма близки к спектрам нуклеозидов. [c.38] Спектры четырех нуклеозидов в воде при pH 7 выглядят обманчиво просто (рис. 7.12). Однако электронная структура пуринов и пиримидинов гораздо сложнее, чем белковых хромофорных групп. Основания имеют очень низкую симметрию и много несвязывающих электронов. Сопоставление со спектрами ряда более простых молекул показывает, что у всех оснований в области от 200 до 300 нм должно проявляться несколько разных п — 7г -и тг — 7г -переходов. Кажущиеся простыми полосы поглощения аденина и ураци-ла с = 260 нм, имеющие вид гауссовых кривых, в действительности порождаются более чем одним переходом. G и С, имеющие на первый взгляд лишь по две полосы, на самом деле, вероятно, обладают большим числом невыявленных полос. [c.38] УФ-области обусловлено несколькими переходами. Это сильно усложняет анализ влияния конформации на спектры нуклеиновых кислот. [c.39] Спектры всех четырех нуклеозидов чувствительны к pH. Протонирование С и G приводит к значительному сдвигу поглощения в сторону ббльщих длин волн (красное смещение). Депротонирование U или Т при щелочных pH также приводит к существенному красному смешению максимума поглощения. Протонирование А сопровождается гораздо меньщими, но вполне поддающимися регистрации спектральными изменениями. Все эти эффекты весьма полезны для определения степени ионизации отдельных составляющих нуклеиновых кислот, однако в полимерах они становятся более сложными из-за сильного электронного взаимодействия между основаниями. Позже мы обсудим эту проблему. Присутствие фосфатных групп, по-видимому, не сказывается сколько-нибудь заметно на молярной экстинкции различных составляющих нуклеиновых кислот. Например, значения и для АТР, ADP, АМР, аденозина и 3 - или 2 -адениловой кислоты оказываются в пределах ощибки эксперимента одинаковыми. [c.40] Энергия длинноволновых, достаточно интенсивных электронных переходов пяти наиболее распространенных оснований почти одинакова. Это служит серьезным препятствием для детального анализа электронных спектров ДНК и РНК. Полосы поглощения отдельных хромофоров типичной нуклеиновой кислоты сливаются и дают простую на вид полосу с гпах 260 нм (рис. 7.14). Свойства отдельных оснований оказываются весьма близкими, так что даже в отсутствие достаточно сильного взаимодействия между основаниями трудно представить полосу поглощения с = 260 нм для нуклеиновой кислоты в виде суммы четырех составляющих с определенными весами. [c.40] НОГО взаимодействия с другими группами. Такие примеры известны, но они крайне редки, и мы не будем их рассматривать Все остальные возможности относятся к разряду более слабых взаимодействий. Свойства хромофоров могут меняться в зависимости от локального окружения или от взаимодействия его с соседними хромофорами. Рассмотрим сначала обычный эффект окружения. Это может быть влияние и локального pH, и диэлектрической проницаемости, и жесткости среды, и нгшичия соседних групп, способных вступать в специфические химические взаимодействия (такие, как перенос заряда или протона, связывание с ионом металла). Мы остановимся здесь только на влиянии полярности растворителя. [c.42] Спектры многих хромофоров зависят от растворителя. Эта зависимость может проявляться в изменении интенсивности, формы полос или длины волны, при которой наблюдается максимум поглощения. Когда свободные хромофоры (скажем, триптофан) находятся в водном растворе, окружающей средой для них является, вообще говоря, вода. Это справедливо и для триптофана, расположенного на поверхности белковой молекулы. Однако из-за довольно сильно выраженной гидрофобности триптофана его боковая группа будет, как правило, спрятана в глубине белковой молекулы, где ее окружение ближе всего к углеводородному растворителю, а вовсе не к водному раствору. [c.42] Резкие изменения окружения хромофора, например замена полярной среды на неполярную, оказывают существенное влияние на разность энергий между электронными состояниями и, следовательно, на полосы поглощения. В общем случае влияние растворителя должно проявляться в понижении средней энергии любого уровня. Взаимодействия между растворителем и растворенным веществом чаше происходят при взаимных ориен-тащ1ях, благоприятствующих притяжению, чем при ориентациях, способствующих отталкиванию, подобно тому как молекула с большей вероятностью будет находиться в конформации с низкой энергией, чем в высокоэнергетической конформации. Чем больше полярность растворителя, тем сильнее должны быть эти взаимодействия. Однако для того, чтобы произошел сдвиг частоты поглощения, необходимо изменить относительную энергию двух состояний. [c.42] Количественный анализ влияния растворителя на спектр поглощения представляет собой чрезвычайно трудную задачу. Когда хромофор находится в основном состоянии, молекулы растворителя располагаются так, чтобы их энергия была минимальной. Процесс возбуждения происходит за время порядка 10 с, что значительно меньше характерных времен молекулярных движений. Таким образом, чтобы вычислить длину волны, при которой будет наблюдаться поглощение, нужно знать энергию возбужденного хромофора при конфигурации молекул растворителя, присущей основному состоянию. В таких вычислениях необходимо учитывать два фактора высокочастотную диэлектрическую проницаемость (определяемую поляризуемостью) и постоянный дипольный момент. Эти факторы различаются тем, что эффекты, связанные с поляризуемостью, проявляются достаточно быстро в ответ на перераспределение электронов при возбуждении, в то время как эффекты, связанные с постоянным дипольным моментом, характеризуются гораздо большими временами. [c.42] Примером может служить определяющая роль третичной структуры в образовании двугранных углов дисульфидных связей. [c.42] Когда преобладают эффекты поляризуемости, ясно, что в полярном растворителе будет преимущественно уменьшаться энергия электронного состояния хромофора с наибольшим дипольным моментом. Поскольку этим состоянием почти всегда является возбужденное состояние, мы приходим к выводу, который, как вскоре будет показано, справедлив для т — Я- — переходов в полярных растворителях спектр поглощения сдвигается в сторону больших длин волн. [c.43] В качестве простой иллюстрации влияния растворителя рассмотрим хромофор мезитил-оксид (СНз)2С=С—СО— Hj. Поглощение этой молекулы в ближней УФ-области обусловлено переходами между тремя уровнями тг, тг и п. Наиболее низкоэнергетическими являются переходы тг — тг и п — тг. Мы рассмотрим влияние растворителя, связанное только с поляризуемостью. Поскольку я--орбиталь является связывающей, электрон на этой орбитали будет находиться главным образом между ядрами связанных атомов, и его энергия должна изменяться под влиянием растворителя меньше, чем энергия электрона, находящегося на разрыхляющей я- -орбитали. Замена неполярного растворителя на полярный приведет к уменьшению разности энергий я-- и я- -орбиталей и вызовет красное смещение спектров поглощения (табл.7.3 рис. 7.15). Находясь на п-орбитали, электрон будет взаимодействовать с растворителем сильнее, чем даже электрон я- -орбитали. Заполненные п-орбитали могут служить, например, акцепторами при образовании водородных связей. Следовательно, можно сделать вывод, что в более полярном растворителе разность энергий между п- и я- -уровнями будет возрастать, приводя к сдвигу спектра в сторону меньших длин волн (голубое смешение). [c.43] Влияние полярности растворителя на энергию тг — тг - и п — тг -переходов./4. Уровни энергии. Б. Схематическое изображение спектров для полярного (незакрашенные прямоугольники) и неполярного (закрашенные прямоугольники) растворителей. [c.44] Спектральный анализ требует не столь прямолинейного подхода. Весьма успешным оказался метод спектроскопии возмущения растворителем , при котором регистрируют спектры (или разностные спектры) в постепенно изменяющейся последовательности растворителей. Такую последовательность получают, добавляя небольшими порциями слабо полярный растворитель (например, зтанол). Если при этом в белке не происходит конформационных перестроек, его спектральные свойства будут плавно изменяться. Следя лишь за изменениями спектра, можно исследовать свойства экспонированных остатков, которые и чувствуют состав растворителя. Эти изменения носят сходный характер для различных белков, поскольку на внешнем окружении не сказываются детали структуры белка. Для остатков триптофана и тирозина были получены эталонные кривые спектральных изменений, связанных с изменением состава растворителя. Пользуясь этими кривыми, можно определить, какие ароматические остатки расположены на поверхности разных белковых молекул. Зная общий аминокислотный состав, можно затем найти число спрятанных остатков. [c.44] На рис. 7.16. приведены спектры при возмущении растворителем для альдолазы. При pH 6 экспонированы два ароматических остатка Тгр-2 и Туг-18. Изменения состава со-лровождаются довольно резкими спектргшьными изменениями, т.е. в молекуле белка происходят конформационные перестройки. При еще более высоких концентрациях неполярного растворителя вновь можно следить за экспонированными остатками, однако следует помнить, что белок в этих условиях не является нативным. Из рис. 7.16 видно, что при pH 1 число экспонированных ароматических остатков в альдолазе гораздо больше, чем при pH 6, т.е. при pH 1 белок обладает весьма развернутой конформацией. [c.45] Чувствительность ароматических хромофоров к составу растворителя является чрезвычайно полезным свойством. Даже в тех случаях, когда спектры оказываются очень сложными для анализа, спектральные изменения могут с успехом использоваться для выявления конформационных перестроек. В последующих главах мы рассмотрим много таких примеров. [c.45] Вернуться к основной статье