ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Коммерческие препараты сред для оптимизации условий роста клеток млекопитающих из "Культура животных клеток Методы" Можно выделить три категории сред, предлагаемых различными фирмами для оптимизации культур клеток млекопитающих (табл. 2.3). [c.51] При культивировании клеток, зависящих от субстрата, поверхность культуральной посуды часто покрывают положительно заряженным полимером (например, поли-О-лизином [2]). [c.52] Осторожно вращая чашку, распределите раствор равномерно по всей поверхности. [c.52] Коллаген типа I может быть получен с помощью метода Строма и Микалопулоса [19] из сухожилий, связанных с позвонками хвоста крыс. [c.53] Исходный маточный раствор коллагена может быть также нейтрализован и разведен культуральной средой. В этом случае коллаген образует гель благодаря повышенным значениям pH и концентрации солей. Денатурированный (высушенный на воздухе) коллаген облегчает прикрепление клеток (например, клеток эндотелия и скелетных мышц), а нативный (неденату-рированный) коллаген может оказаться необходимым для правильной фенотипической экспрессии. [c.53] Прежде чем перейти к детальному описанию методов культивирования в суспензии и в монослое и соответствующего оборудования, остановимся на некоторых общих аспектах культивирования клеток, многие из которых существенны для обеих систем. [c.57] Для увеличения размера клеточных культур необходимо знакомство с некоторыми биологическими концепциями и методами. При работе с небольшими культурами сохраняется известная свобода для ошибок . Если культура погибнет, это будет досадно, но не катастрофично с точки зрения потери времени и денег. По мере того как масштаб культуры увеличивается, для ее поддержания требуется все больше ресурсов. Гибель культуры становится все более серьезным событием, и одновременно растут требования системы к более точному соблюдению всех условий культивирования. В этом разделе будет приведено описание всех главных компонентов систем культивирования клеток, на которые следует обращать особое внимание при увеличении масштабов культур и разнообразия конструкций и способов управления. [c.57] Методы определения общего количества клеток (путем подсчета в гемоцитометре целых клеток или окрашенных ядер) и общей клеточной массы (путем определения сухого веса или количества белка) нетрудны. Сложнее получить правильное представление о жизнеспособности клеток, поскольку принятые методы либо повреждают клетки, либо используют специфические, но не обязательно типичные параметры физиологии клетки (см. гл. 8). Дополнительные трудности создаются тем, что во многих системах культивирования нельзя осуществить отбор проб (большинство культур клеток, зависящих от субстрата) или визуальное наблюдение, так что приходится прибегать к непрямым измерениям. [c.57] Типичные значения выхода биомассы для глюкозы (10 кле-ток/г) составляют 385 для клеток MR -5, 620 для клеток Vero и 500 для клеток ВНК. [c.58] По мере того как культуральные системы становятся более крупными и сложными, увеличивается и необходимость соединений различных блоков системы. Для таких соединений можно использовать комбинации трубок из силикона и нержавеющей стали. Силиконовые трубки обычно проницаемы для газов, что может стать источником проблем при использовании их для перекачки сред вследствие потери растворенного СО2. Они также подвержены быстрому износу при использовании в перистальтических насосах. Следует использовать толстостенные трубки с дополнительными усиливающими элементами (втулками). При соединении силиконовых трубок с трубками из нержавеющей стали закрепляйте участки соединения пластиковыми скобами для предотвращения разъединения в системе в процессе работы. Используйте силиконовые наконечники на концах трубок из нержавеющей стали, чтобы не поцарапать культуральные сосуды и избежать механического повреждения клеток. [c.59] Часто возникает необходимость соединять несколько сосудов системы в ходе культивирования или же собирать систему после автоклавирования отдельных блоков. Соединение должно осуществляться в стерильных условиях, так что приобретение специализированных соединительных коннекторов, хотя и требует определенных затрат, но полностью себя оправдывает (например, линии, поставляемые LH Fermentation). [c.59] Стандартная кривая роста культуры начинается с лаг-фазы, за которой следуют фаза логарифмического роста, стационар-Бая фаза и фаза снижения количества и гибели клеток (рис. 3.2). Такой характер роста подтвержден результатами многих исследований, (см. гл. 1). Термин рост клеток обычно относят к увеличению их количества, хотя увеличение клеточной массы может происходить без репликации клеток. Различия в средней массе клетки оказываются весьма значительными при сравнении различных клеточных популяций, однако и в рамках одной популяции величина средней массы клетки может варьировать. [c.62] Многие типы клеток либо абсолютно зависят от добавления определенных факторов роста, либо достигают оптимального роста только в присутствии этих факторов (см. гл. 2). [c.64] Оптимальный pH среды должен быть близок к 7,4 в начале культивирования и пе снижаться ниже 7,0 в ходе культивирования. Однако для многих линий гибридом оказывается предпочтительным pH около 7,0. При pH ниже 6,8, как правило, наблюдается подавление роста клеток. Среди факторов, влияющих на стабильность pH, следует отметить тип буфера и его емкость, объем воздушного пространства культуры и концентрацию глюкозы в среде. [c.65] Метаболизм глюкозы в клетках приводит к накоплению пи-рувата и лактата. Глюкоза метаболизируется значительно быстрее, чем это нужно для поддержания роста. Следовательно, концентрация глюкозы в среде не должна превышать 2 г/л. [c.66] И лучше добавлять глюкозу в среду в ходе культивирования, чем повышать начальную ее концентрацию. В качестве альтернативы можно заменять глюкозу на галактозу и фруктозу. При этом заметно снижается образование молочной кислоты, но одновременно, как правило, снижается и скорость роста культуры. Такая замена замедляет снижение значений pH среды и достаточна для поддержания небольших культур. По мере увеличения масштабов культуры происходит снижение объема газовой фазы и поверхности культуральной среды по отношению к ее объему. Кроме того, были созданы многочисленные системы с увеличенной поверхностью для роста клеток и увеличенной клеточной плотностью по отношению к объему культуры. В результате проблема pH возникает на более ранних стадиях культивирования, поскольку СОг удаляется менее эффективно и увеличение количества клеток приводит к увеличению образования молочной кислоты и СОг. Выходом из создавшегося положения является более частая смена среды или создание систем контроля pH. [c.66] В стационарных и поверхностно аэрируемых культурах, обычно используют параметр К1а, обладающий размерностью [объем/ /час] и представляющий собой коэффициент переноса массы) С — концентрация растворенного кислорода в среде при насыщении и С — действительная концентрация кислорода в данный момент времени. [c.68] Вернуться к основной статье