ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинадии из "Микробиология с техникой микробиологических исследований изд.4" Сущность непрямой, или пассивной, реакции гемагглютинации (РНГА) заключается в том, что эритроциты, обладая способностью адсорбировать на себе антигены, становятся чувствительными (сенсибилизированными) к соответствующей иммунной сыворотке. Под воздействием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат. [c.124] Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РНГА позволяет обнаруживать минимальные количества-антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. [c.124] Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пластинках из органического стекла с лунками. [c.124] Из крови берут осадок эритроцитов в объеме 0,1—1 мл и. 2--3 раза отмывают его от остатка сыворотки в десятикратном объеме стерильного изотонического раствора хлорида натрия. После каждого центрифугирования (при 2000— 3000 об/мин) надосадочную жидкость сливают, заменяя свежим изотоническим раствором хлорида натрия. [c.124] После промывания эритроцитов приступают к сенсибилизации их антигеном. Отмытые эритроциты в объеме от 0,1 до 1 мл смешивают с антигеном, количество которого определяется его качеством и способностью адсорбироваться на эритроцитах. Смесь антигена с эритроцитами помещают в термостат на 1—2 ч, а иногда, по условиям опыта, на более лродолжительное время. После инкубации взвесь сенсибилизированных эритроцитов центрифугируют, отмывают 2—3 раза изотоническим раствором хлорида натрия и из промытого осадка готовят 0,5—1% взвесь эритроцитов для постановки реакции гемагглютинации. Приготовленная взвесь может храниться в холодильнике при температуре 3—4°С до появления признаков гемолиза. [c.125] Однако описанный способ сенсибилизации эритроцитов пригоден только для тех случаев, когда антиген относится к группе полисахаридов. Антигены белковой природы адсорбируются эритроцитами очень слабо и поэтому при добавлении соответствующей иммунной сыворотки реакция гемагглютинации не наступает. [c.125] Для адсорбции крупномолекулярных антигенов белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином, который уплотняет и изменяет физико-химические свойства их поверхности и повышает адсорбционную способность. Взвесь эритроцитов (2,5%) в изотоническом растворе хлорида натрия pH 7,2 смешивают с равным объемом раствора танина 1 20 ООО, приготовленного на обычном изотоническом растворе хлорида натрия, и ставят на 10—15 мин в термостат или водяную баню при 37°С. По истечении указанного времени смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов промывают фосфатно-буферным раствором при pH 7,2. Надосадочная жидкость может быть окрашена в желтый или желтовато-розовый цвет, что обусловлено токсическим влиянием танина на эритроциты. [c.125] После обработки танином устойчивость эритроцитов, взвешенных в изотоническом растворе хлорида натрия, снижается. Поэтому для приготовления стойкой взвеси пользуются стабилизатором — раствором нормальной сыворотки кролика. Сыворотку, полученную от кроликов-доноров, инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин, истощают от неспецифических гемагглютининов, прибавляя к 1 мл инактивированной сыворотки 0,5 мл осадка отмытых нормальных эритроцитов. Смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре, центрифугируют, отсасывают сыворотку и непосредственно перед использованием разводят ее в 100 или 250 раз. [c.125] Для устранения неспецифических гемагглютининов вместо адсорбции можно пользоваться прогреванием исследуемых сывороток при температуре 65°С в течение 20 мин. [c.126] Результат реакции агглютинации учитывают после осаждения эритроцитов в контрольных пробирках непосредственно после инкубации в термостате при температуре 37°С или после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 18—24 ч. [c.126] После удаления неспецифических гемагглютининов из исследуемой сыворотки и определения рабочей дозы антигена приступают к постановке РТНГА. Из исследуемой сыворотки готовят ряд последовательных разведений с учетом того разведения, которое было сделано при удалении из нее неспецифических гемагглютининов. При постановке реакции обычным способом сыворотку разводят в объеме 0,5 мл, при постановке в микротитраторе — в объеме 0,025 мл. [c.127] Постановке реакции сопутствуют два контроля КС и КА. [c.127] К каждому разведению сыворотки (кроме КС) добавляют рабочую дозу антигена в объеме 0,5 мл (или 0,025 мл). Содержимое лунок тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре или температуре термостата (в соответствии с условиями реакции) на время, необходимое для нейтрализации системы антиген — антитело. [c.128] По истечении времени, необходимого для осуществления реакции, во все лунки ряда, в том числе в лунки с КС и КА, добавляют в объеме 0,1—0,5 мл (при микрореакции—в объеме 0,025 м) 1% взвесь сенсибилизированных эритроцитов с предварительно оттитрованной рабочей дозой антигена. [c.128] Для лучшего перемешивания смеси панель постукивают по углам и оставляют при комнатной температуре или температуре термостата на время, которое по условиям реакции необходимо для агглютинации сенсибилизированных эритроцитов гомологичным антигеном. [c.128] Результат реакции оценивают по внешнему виду осадка эритроцитов. При положительной реакции на дне лунки образуется диск или кольцо из осевших эритроцитов. Это свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке антител, гомологичных добавленному антигену, вследствие чего агглютинации эритроцитов не происходит. При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты, агглютинированные свободными антителами, располагаются в виде перевернутого на дне лунки зонтика. [c.128] Реакция преципитации относится к числу наиболее простых и ускоренных методов серологического анализа. В оско-ве реакции лежит образование видимого осадка, состоящего из вступивших друг с другом в соединение антител и молекулярных антигенов (например, бактериальных белков или полисахаридов, образовавшихся при разрушении микробных тел). По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. Основным различием между ними является то, что в первом случае применяется корпускулярный антиген, а во втором — антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. [c.128] Другим существенным различием является то, что агглютинация представляет собой количественный метод исследования, с помощью которого устанавливают титр агглютининов, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. Реакция преципитации— качественный метод исследования, при котором диагностическое значение имеет появление садка в реагирующих жидкостях. [c.128] Для обозначения антигенов, участвующих в реакции преципитации, принят термин п р е ц и п и т и н о г е н , для антител — п р 8 ц и п и т и н , для специфического осадка, образующего в результате реакции — преципитат . Преципитат, возникающий вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена, может иметь вид кольца, формирующегося на границе антигена с иммунной сывороткой, или аморфного осадка, выпадающего на дно пробирки. [c.129] Вернуться к основной статье