ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ из "Иммунология Методы исследований" Уравнением (2) можно точно описать равновесие реакций между одновалентным антителом и одновалентным антигеном (растворенным или связанным с клеткой) или между двухвалентным антителом и одновалентным антигеном в растворе. Оно также справедливо для реакции двухвалентного антитела и двухвалентного антигена в растворе, если одни из двух реагентов имеется в избытке (например, если можно пренебречь концентрацией комплексов, образованных антителом и антигеном с помощью лишь одного связывающего участка). Однако, как правило, это уравнение не годится для описания взаимодействия двухвалентного антитела с одновалентным или двухвалентным антигеном, связанным с клетками, так как в этом случае величина /С ие всегда будет независнмой от концентрации реагентов (разд. V). Однако при определенных условиях уравнение (2) может быть применено и в этих случаях. Некото рые связанные с этой проблемой вопросы обсуждаются в разд. V. [c.14] К н В могут быть найдены из зависимости х1 А—д ) от л , если можно опытным путем раздельно определить х (молярную концентрацию связанных антител при равновесии) и А—х (молярную концентрацию несвязанных антител). К характеризует наклон прямой, а В — это отсекаемый ею отрезок оси х. Величина В получается путем экстраполяции при х А—л )=0, т. е. при А— -оо. Иначе говоря, В соответствует максимальному количеству антител, которое может быть связано с клетками в единице объема в условиях эксперимента, а следовательно — концентрации единиц антигена. Прн известной концентрации клеток Ь] среднее число п единиц антигена иа клетку можно получить из уравнения [Л]=п[Ь]. Так как обычно Ь выражают числом клеток в 1 см (клерку можно рассматривать как молекулу с валентностью п), В тоже следует выражать числом молекул в 1 см . [c.14] Экспериментальные данные можно представлять в виде графика согласно уравнению (3) либо (4). Хотя использование уравнения (3) кажется более прямым подходом, чем использование уравнения (4), с точки зрения наглядности, однако, уравнение (4) имеет преимущество, так как зйачение п здесь может быть найдено непосредственио из графика зависимости rj[A x от г. В обсуждаемых далее примерах будет использован именно этот последний метод. [c.15] Все IgG мыши при pH 8 адсорбируются на колонке стафилококкового белка А. иммобилизованного на сефарозе 4В. Как правило, yi элюируются при pH 6, У2л при pH 4,5, а Ysb при pH 3 (Еу et al., 1978). Слева — элюцня IgG, содержавшихся в асцитной жидкости при развитии вторичной опухоли у мышей, которым имплантировали клетки гибридомы. В средине — элюция IgG, адсорбированного из 50 мл СПК (примерно 50 мл СГГк содержится в 300 мл культуральной надосадочной жидкости). Справа — элюция специфических антител, адсорбированных из 300 мл надосадочной жидкости, к которой была добавлена СПК, предварительно очищенная от бычьего IgG. Из 300 мл надосадочной жидкости можно, как правило, выделить около 7— 10 мг чистых антител. [c.19] В наших опытах биосинтетическое включение Н-лейцина в антитела также ие давало хороших препаратов. Необходимость использовать сциитнляцнониые жидкости для подсчета р-излу-чения сильно снижает воспроизводимость и точность измерений. [c.20] Подходящий для работы диапазон концентраций антител, который зависит от величины К, следует определить в предварительных опытах. [c.23] Для достоверного измерения К обычно достаточно опытов с 6—10 различными разведениями. Число параллельных проб должно быть от 3 до 5. В качестве внутренних коитролей на воспроизводимость опыта следует также провести параллельные пробы с различными разведениями клеточной взвеси и с эквивалентными количествами моиоклоиальиых 1-аитител. Совпадение полученных кривых указывает на достоверность результатов (разд. 111, Ж). [c.23] Константу равновесия К и максимальное число п молекул антител, которое может быть связано с одной клеткой, находят путем графической экстраполяции уравнений (3) илн (4). Точки, через которые проводится прямая, берут нз измерений первого добавленного количества антител А и различных величин X, полученных прн других концентрациях антител. [c.24] Регрессионный анализ проводится с помощью компьютера. Линию регрессии через разбросанные на диаграмме точки проводят, пользуясь методом наименьших квадратов. Величины К и п вычисляют вместе с их стандартными отклонениями (разд. IV). [c.24] Достоверность получаемых данных может быть проверена либо дополнительными опытами, либо соответствующими конт-ролями. [c.25] Рассмотренные выше вопросы будут проиллюстрированы в этом разделе детальным описанием одного эксперимента. В нем определялись константы равновесия и число детерминант HLA, A-fB-f на поверхности лимфоцитов с помощью моноклональных антител антн-HLA. Мишенями служили клетки линии WT 20, трансформированной вирусом Эпштейна — Барра (Tru o et al., 1980). [c.27] Антитела к HLA метили с помощью реактива Болтона — Хантера. Максимальное нх присоединение к клеткам-мишеням составляло около 68% (рис. 5). На основе предварнтельны.х проб была подобрана начальная (номинальная) доза моноклональных 251 аитител, содержащая 1 мкг белка. [c.27] Линейная форма уравнения закона действующих масс Для построения графика использованы данные опыта, подробно описанного в тексте (разд. IV и табл. 1). Линия регрессии проведена методом наименьших квадратов с учетом стандартных отклонений. (Tru o et а ,, 1980). [c.28] На рис. 8 показан график зависимости г/(Л—М (ордината) от безразмерной величины г-Ю (абсцисса). Из этой зависимости легко получить величины К (в М ) и п, так как отрезки осей у и х, отсекаемые прямой соответственно при х 0 и у=0, равны Кп и п. [c.29] Как мы отмечали в разд. II, уравнения (3) и (4) могут давать верное представление о связывании одновалентного антитела с одновалентным или поливалентным антигеном в растворе или иа поверхности клеток, а также о связывании двухвалентного антитела с одновалентным антигеном в растворе. Реакции между двухвалентным антителом и двухвалентным или поливалентным антигеном в растворе или между двухвалентным антителом и одно- илн поливалентным антигеном клеточной поверхности ие бывают, как правило, одноэтапными, и аппроксимации возможны лишь при ряде ограничений. [c.29] Где Аг и кг скорости прямой и обратной реакций соответственно. [c.31] Вернуться к основной статье