ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Список авторов из "Методы исследований в иммунологии" Обычным титрованием определяют конечную точку, которая зависит как от количества, так и от качества реагентов. Реакцию, лежащую в основе титрования, можно свести к реакции практически нулевого порядка, работая при большом избытке одного из компонентов, и тогда количество другого компонента может быть оценено независимо. Но в таких системах нельзя определить качество реагентов, поскольку оно либо проявляется только вместе с количеством, либо совсем не оказывает влияния. Это справедливо и для бинарных реакций (таких, как реакция преципитации в растворе или в геле, активная или пассивная агглютинация, связывание комплемента и т. п.), и для тройных систем, где акцептор и индикатор конкурируют за третий компонент (например, при ингибировании любой бинарной реакции, нейтрализации токсинов или живых патогенных организмов и т. д.). [c.11] Простейшей мерой сил, связывающих эпитоп и паратоп, т. е. мерой качества последних в им,мунологическом смысле, служит константа равновесия. В тех случаях, когда изучается не только величина, но и природа этих сил, нужно определять термодинамические параметры (такие, как изменения энтальпии, энтропии, теплоемкость и т. д.). Все это сводится, однако, не более чем к измерению констант равновесия при разных внешних условиях (обычно при разных температурах, реже при изменении давления или объема). Поэтому в настоящей главе речь идет о теории и практике определения констант равновесия иммунологических реакций. [c.11] Равновесная концентрация х, которая достигается при I ,, есть, очевидно, Х2, т. е. меньший корень уравнения (5). [c.13] В уравнении. (56) не учитывается то, что эпитопы находятся на частицах и потому встречаются в реакционной смеси в виде групп по п штук. Можно, однако, показать, что при отсутствии взаимодействия между эпитопами их поведение не зависит от того, встречаются ли они поодиночке или как части поверхности корпускулярных носителей (Примечание 2). [c.14] Уравнение (5) может быть решено численно для любого набора наблюдаемых величин. Однако квадратичная форма (см. Примечание 1) неудобна для графического изображения и особенно для статистической оценки параметров. Параболу следует преобразовать в прямую линию, после того как решено, какие оценки мы хотим сделать. [c.15] Для практических измерений по крайней мере один из трех компонентов, составляющих равновесную смесь (свободные эпитопы, свободные паратопы, комплексы эпитоп — паратоп), должен быть отделен от двух других. Если имеется существенная разница в размерах, разделение не составляет труда. Так, гаптены будут диффундировать сквозь мембраны, задерживающие антитела, создавая с наружной стороны мембраны концентрацию, равную [Е—х]К В случае корпускулярных антигенов оставшиеся свободными антитела [Р—х] могут быть отделены либо в виде надосадочной жидкости после центрифугирования, либо в виде фильтрата при пропускании равновесной смеси через фильтр, задерживающий антиген, а значит, и комплексы антиген — антитело. Когда два реагента имеют сходные размеры, как, например, в реакциях идиотоп — антиидиотоп, простое механическое разделение невозможно. В этих случаях используются другие приемы (в частности, мечение одного из реагентов и использование преципитирующего агента к одному из них, регистрация образования комплексов по каким-либо физическим, обычно оптическим, изменениям в системе или привязывание одного из реагентов к нерастворимой основе или к частицам носителям, что позволяет далее воспользоваться механическим разделением). [c.15] В любом случае нужно определить концентрацию выделенного реагента, т. е. (Е—х) или (Р—х), и сравнить ее с исходной концентрацией [ ] или [Р]. Поэтому принято выражать х в долях от исходной концентрации реагентов, В большинстве случаев мы вынуждены прибегать к такой практике, поскольку обычно удается определить только титры (т. е. неизвестные кратные абсолютных концентраций), причем ] и [Р] сами являются параметрами, которые нужно определить. [c.16] Уравнение (11) может быть представлено в шести эквивалентных формах, которым соответствуют шесть различных линейных анаморфоз. Эти формы получаются умножением обеих частей уравнения на один из общих множителей и приведением к виду у=а+Ьх (Примечание 3). [c.16] В наших обозначениях н, как можио видеть, эквивалентно уравнению (На), помноженному иа AIE. В литературе эти линейные формы обычно связывают с именами авторов (отложение Скэтчарда, отложение Лайнвивера — Бёрка и т. д.). Стремление увековечить авторство по поводу столь тривиальных преобразований кажется иам чрезмерной данью тщеславию. [c.17] Уравнения (Па) и (Не), если их оценивать статистически, наиболее предпочтительны/ Оба имеют наклоны, которые можно оценить весьма точно, пересечения с осью у для уравнения (Па) и с осью X для уравнения (Пе) достигаются при минимальной экстраполяции и достаточно далеки от нуля. Информация, извлекаемая из этих двух уравнений, совершенно одинакова, поскольку одно из них является обратной функцией по отношению к другому. Их общий недостаток — то, что Р не может определяться независимо и всегда содержит ошибку определения К. [c.19] Следующая пара — уравнения (Пг) и (Пд)—дает удовлетворительные оценки К (содержащиеся в координатах пересечения осей у и х), по плохо служит для оценки Р, хотя наклон и не зависит от К. [c.19] Последняя пара — (Пб) и (Пв) — имеет пересечения осей х и у вблизи начала координат и потому будет давать надежные оценки Р только в том случае, если экспериментальные точки будут укладываться на теоретическую прямую с малым разбросом. Из этих двух предпочтительнее уравнение (Пв), так как оно обеспечивает независимые оценки параметров Р и /С. [c.19] Поскольку даже простейший антиген может стимулировать множество различных клеток, наблюдаемый иммунный ответ является суммой большого, обычно неизвестного, числа клональных ответов. Уравнение (5) не учитывает этого, и потому наблюдаемая константа равновесия, Ко, — это в действительности среднее значение для неизвестного распределения частных констант равновесия, Ki где само число N неизвестно. [c.19] Как это обычно делают в таких случаях, Полинг и сотр. (Pauling et al., 1944) предположили нормальное распределение для свободных энергий ассоциации, т. е. логарифмически-нормальное для К (Примечание 4). [c.19] При этих условиях предположение о нормальности распределения сохраняют просто как наиболее удобный компромисс кроме того, оказалось, что оно оправдывается иа практике, если измерения не охватывают слишком широкой области. [c.20] Индекс гетерогенности, а, можно определить непосредственно по наклону прямой линии, а Ко пересчитать из координаты пересечения с осью у или лучше прямо из координаты пересечения с осью X. Значение а лежит между О и 1, причем гомогенности соответствует а=1. [c.20] Это явление — скрытый источник ошибок при оценке гетерогенности, которую как раз и определяют при разных концентрациях реагентов. Однако существует простой способ учета комплексных связей. Дело в том, что РаЬ-фрагменты данной популяции антител имеют то же сродство и ту же гетерогенность, что и исходная популяция, но не образуют комплексных связей. Поэтому различие и а, определенных для антисыворотки и для полученных из нее Fab-фрагментов, может служить мерой образования комплексных связей. [c.21] Вернуться к основной статье