ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Свойства бычьего сывороточного альбумина и некоторые примеры иммобилизации из "Химия привитых поверхностных соединений" По классификации белков, основанной на их растворимости, принятой в 1907-1908 гг. (и используемой до сих пор) альбуминами называются белки, растворимые в воде и солевых растворах. При этом строгих границ между классами не существует. Например, четкое разграничение между альбуминами и глобулинами невозможно, если исходить только из их растворимости в воде и солевых растворах, т.к. существуют глобулины, легко растворимые в воде (псевдоглобулины) и нерастворимые в воде, свободной от солей (эуглобулины). Как альбумины, так и глобулины не имеют особенностей в смысле содержания отдельных аминокислот, как, например, у основных протаминов, богатых аргинином, или у структурных белков склеропротеинов (составляющих шерсть, кожу и т.д.), имеющих повышенное содержание глицина, аланина и пролина. Однако у этих белков физиологические функции существенно различаются. [c.548] Альбумин по классификации, основанной на функциональных различиях, относится к транспортным белкам. Он ответствен за перенос билирубина и жирных кислот [91, т. I, с. 43], поэтому должен хорошо адсорбироваться на привитых группах, проявляющих заметные дисперсионные взаимодействия, например, на алкильных или ароматических. При рассмотрении физико-химических свойств альбумина в качестве одного из главных параметров состояния используется размер и форма молекулы. В качестве альтернативных, но значительно менее универсальных параметров, могут использоваться результаты иммунологических тестов и некоторые другие, также связанные с конформационными изменениями пептидной цепи. [c.548] По сравнению с другими белками сывороточные альбумины изучены довольно хорошо. По своему строению молекула нативного белка близка к эллипсоиду вращения и может быть охарактеризована как молекулярный кристалл со строгой конформационной структурой полипептидной спирали — цепи, свернутой определенным образом и поддерживаемой внутримолекулярными дисульфидными цисти-новыми мостиками, ионными и водородными связями между содержащимися в молекуле ионогенными группами, а также гидрофобными взаимодействиями между углеводородными фрагментами аминокислот. Следует отметить, что в структуре кристаллического белка существенную роль играют молекулы воды. Известно, например, что даже после тщательной низкотемпературной сушки вода составляет около трети массы кристаллического белка. В то же время факт отсутствия молекул воды внутри молекул глобулярных белков был доказан методом дифракции рентгеновских лучей [38, с. 176]. Это косвенно подтверждается и экспериментами по измерению скорости водородно-дейтериевого обмена, из которых следует, что лишь часть атомов водорода в группах —ОН, —NH2 и =КН обменивается практически мгновенно, в то время как на обмен остальных атомов требуется несколько часов. В связи с этим Ф. Гауровиц [38] и некоторые другие исследователи высказывают сомнения в пригодности этого метода для изучения конформации белков и вообще в существенной роли водородных связей, равно как и солевых мостиков, в поддержании нативной конфигурации цепи. [c.548] Предположению о существенном вкладе гидрофобных взаимодействий в поддержание нативной структуры противоречит факт чрезвычайной устойчивости альбуминов к действию органических растворителей после осаждения сывороточных белков трихлоруксусной кислотой, экстракции этанолом или ацетоном и последующего диализа против воды удается выделить сывороточный альбумин с сохранением нативной структуры, что доказано химическими, иммунологическими и биохимическими методами анализа [38, с. 215]. [c.549] Молекулу сывороточного альбумина удобнее всего аппроксимировать как эллипсоид вращения и для выражения формы и размеров использовать величины осей (далее а и Ь) и их соотношения а/Ь. Значения этих величин существенно различаются в зависимости от методов измерения и расчета и коррелируют для одинаковых условий измерения (температура, pH, концентрация и ионная сила раствора). Приняв эллипсоид враид,ения в качестве модели молекулы бычьего сывороточного альбумина, по данным, приведенным в [93, с. 71-73], было установлено, что в изоэлектрической точке при нулевой ионной силе молекула характеризуется отношением осей а/Ь, равным 3, а при ионной силе 0,05 молекула становится сферой. При любой ионной силе молекула удлиняется, если pH смещается от изоэлектрической точки. Например в 0,15 М КаС1 при значениях pH = 3,45 3,95 6,30 и 7,40 соотношение осей а/Ь составляет соответственно 5,8 3,3 2,6 и 3,3 (рис. 9.11). [c.549] Это изменение конфигурации бычьего сывороточного альбумина в кислом растворе является очень быстрой реакцией с полупериодом менее 1 сек. [c.549] Определение истинной формы молекул весьма сложно, и при поиске простых моделей следует учитывать их приближенность. Например, из данных по седиментации следует, что эффективный радиус эквивалентной сферы увеличивается с 3,5 до 5,5 нм при изменении pH от 4,23 до 2,29. Одновременно суммарный заряд молекулы альбумина увеличивается с 12 до 74. Очевидно, что эффективный радиус заряженной макромолекулы при седиментации существенно превышает ее геометрический размер из-за взаимного отталкивания одноименно заряженных ча стиц. Отталкивание одноименно заряженных фрагментов в одной макромолекуле, безусловно, должно приводить к некоторому ее набуханию . Все это в различной степени относится и к размерам, установленным иными методами, так что под размерами белковой макромолекулы всегда подразумевается некое поле, эффективное для данного метода измерения. [c.550] По этим соображениям становится понятной важность точного определения изоэлектрической точки белка, однако, поскольку связывание различного рода ионов (особенно многовалентных и органических) значительно изменяет положение изоэлектрической точки белка, она не является постоянной величиной. Для обозначения pH чистого белка в свободной от солей воде употребляется термин изоионная точка (р1). Прямое определение этой константы трудно, а часто и невозможно, осуществить, так как многие белки в отсутствие солей нерастворимы кроме того, проводимость обессоленных растворов крайне низка. Обычно изоионную точку определяют косвенно — путем измерения изоэлектрической точки при различных концентрациях нейтральных солей и экстраполяции к нулевой концентрации [38, с. 122]. К сожалению, в различных источниках наблюдается значительный разброс величин р1 для БСА, например, от 4,7 [94, с. 318] до 5,3 [95, с. 55]. [c.550] Здесь важно заметить, что прочность таких покрытий, равно как и сохраняемость во времени конформации глобул, можно повысить дополнительной внутри-и межмолекулярной сшивкой. Как упоминалось, это довольно распространенный прием. Благодаря своей бифункциональности и высокой реакционной способности, одним из универсальных и наиболее распространенных реагентов для этой цели является глутаровый альдегид, трад1щионно применяющийся в белковой химии (например, как фиксирующее вещество в электронной микроскопии [53]). Более подробно свойства глутарового альдегида рассмотрены ниже. [c.551] Следует учитывать, что из-за вариабельности п число сшивок определить трудно, однако можно надеяться, что при достаточной длительности реакции число затронутых свободных аминогрупп будет приближаться к максимально возможному (для БСА — около 70 на молекулу). Причем для эффективной сшивки концентрацию глутарового альдегида необходимо подбирать таким образом, чтобы количество функциональных (альдегидных) групп реагента не превышало количества реакционноспособных функциональных (аминогрупп) в закрепляемом белке. По причине невозможности точного определения п и неизвестной доступности аминогрупп и расстояний между ними в белковой макромолекуле это соотношение нужно подбирать эмпирически. [c.552] Предполагая, что в процессе приготовления и хранения белкового раствора, а также при модифицировании им сорбента существует опасность заражения бактериями и разложения белка, что может привести к невоспроизводимости результатов, поставили следующий оценочный опыт. В свежеприготовленный отфильтрованный 5 %-й бе.пковый раствор в 0,05 М фосфатном буферном растворе (pH = 7) был добавлен глутаровый альдегид из расчета 10 молекул (в пересчете на мономер) на одну макромолекулу белка, и после перемешивания в течение часа полученный и контрольный (без добавления альдегида) растворы были оставлены в открытом стакане на свету при температуре около 20 °С. Через двое суток в контрольном растворе были отмечены явные признаки разложения помутнение, появление пузырьков и характерного запаха, в то время как в растворе с глутаровым альдегидом эти признаки были едва заметны лишь на четвертые сутки. [c.552] По этим результатам можно видеть, что даже такая легкая сшивка делает белок значительно устойчивее, по крайней мере к действию ферментов. В то же время, такие количества модификатора практически не могут способствовать межмолекулярному взаимодействию и приводить к взаимному разрушению молекул. Во всех синтезах для консервацшт и упрочнения белковых глобул смешиванию с силикагелем предшествовало добавление к белковому раствору указанных микроколичеств глутарового альдегида и перемешивание в течение 1 ч [98, 99]. [c.552] Закономерен вопрос о способе фиксации полученной сшивки. Во-первых, необходимо устранить непрореагировавшие альдегидные группы для предотвращения возможного химического взаимодействия покрытия частиц с компонентами пробы и друг с другом. Для этой цели можно использовать различные агенты, содержащие аминогруппы, или восстановители, например ТРИС, лизин, сульфат аммония, бисульфит или борогидрид натрия. Кинетика реакции и стабильность образующихся продуктов описаны в работе [100]. Во-вторых, некоторые образующиеся альдиминные связи неустойчивы в различных средах, поэтому также нуждаются в восстановлении. Таким образом, в качестве терминатора реакции используется борогидрид натрия. Восстановление непрореагировавших альдегидных групп и образовавшихся связей происходит быстро (20-30 мин. при 6°С) и количественно при соотношении реагент] / [СНО-группы] = 0,5 моль/моль. Временное восстановление и, возможно, частичное перераспределение дисульфидных связей уже после сорбции и межмолекулярной сшивки глутаровым альдегидом не должно существенно нарушить глобулярную структуру белкового покрытия [11-13, 98, 99]. [c.552] Перейдем к иммобилизации белков в более общем виде. Хорошо известно, что белки плазмы крови, по крайней мере млекопитающих, практически мгновенно адсорбируются из раствора на любой границе раздела фаз, в том числе на внесенной в их раствор инородной твердой поверхности. Это существенно затрудняет, например, имплантацию искусственных органов в медицинской практике. Как показывают результаты исследований [101], адсорбирующая активность полиуретана, применяемого в хирургии, в значительной степени зависит от параметров поверхности на молекулярном уровне, что требует очень тонкой регулировки соотношений при добавке сополимеров (мочевины) и других условий синтеза. Иначе уже при незначительном отклонении от этих условий полиуретановые матрицы становятся удобны для использования в качестве подложки для выращивания, например, бактериальных культур, т. е. имеют высокое сродство к белкам. [c.553] Из приведенных экспериментальных данных следует, что достигнуть плотного белкового покрытия на силикагеле довольно легко. Тем более это должно относиться к поверхностям с развитой структурой на молекулярном и надмолекулярном уровнях, как в случае аморфного силикагеля, модифицированного полярными функциональными группами на углеводородной ножке . [c.554] Более того, как видно из числовых характеристик, макромолекулы при адсорбции, по-видимому, претерпевают некоторые специфические изменения, обусловли-ваюш,ие дальнейшую сравнительно прочную многослойную сорбцию. [c.554] Таким образом, при создании на поверхности модифицированного силикагеля белкового покрытия контролируемой толщины требуется снижение адсорбционной активности альбумина, что может быть достигнуто повышением ионной силы раствора или снижением концентрации белка. В первом случае высокая концентрация противоионов улучшает экранирование полярных групп белка и на поверхности силикагеля, тем самым уменьшая прочность контактов белок-белок и белок-поверхность, поэтому для повышения прочности и однородности образующегося покрытия второй вариант, на наш взгляд, более предпочтителен. [c.554] Вернуться к основной статье