ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Свойства продажных амфолитов из "Исследование биологических макромолекул методами" Главная проблема, возникающая при синтезе амфолитов, состоит в том, чтобы обеспечить одинаковую электропроводность в любой точке градиента pH. Полностью решить ее не удается. Амфолиты с р1, лежащими вблизи, нейтральной области pH, диссоциируют все-таки хуже, чем амфолиты с кислыми или щелочными значениями р1, хотя эти различия, конечно, не столь велики, как между глицином и глутаминовой кислотой. В силу этого электропроводность в нейтральной зоне широкого градиента pH в несколько раз ниже, чем на его краях (рис. 4 [Ое1-зета е1 а1., 1979]). На рисунке показаны кривые электропроводности 1%-ных растворов амфолитов трех различных марок. [c.13] Заметно, что наиболее широким интервалом pH, в пределах которого электропроводность меняется незначительно, отличаются фармалиты. При ИЭФ, как и при электрофорезе, малая электропроводность — это преимущество амфолитов, поскольку она позволяет создавать электрическое поле повышенной напряженности без опасности перегрева геля или жидкости. Важно лишь, чтобы эта проводимость была более или менее одинаковой по длине градиента во избежание образования локальных горячих участков. Они могут возникать именно в областях пониженной проводимости вблизи нейтральных значений pH. Это легко понять, если вспомнить, что сила тока одинакова по всей длине градиента, а напряженность поля максимальна именно в этих областях. [c.14] Для полноты сопоставления трех типов фирменных амфолитов на рис. 5 приведены заимствованные из той же работы кривые изменения буферной емкости вдоль градиента pH, также для 1%-ных растворов амфолитов. Видно, что фирмам LKB и Pharma ia удалось создать амфолиты, обладающие примерно одинаковой буферной емкостью вдоль всего диапазона pH, в то время как емкость сервалитов вблизи нейтральных значений pH заметно снижается. Впрочем, следует иметь в виду, что это обстоятельство может привести к осложнениям только в случае высокой загрузки градиента белком, например при препаративном ИЭФ. В аналитическом варианте буферная емкость амфолитов редко является лимитирующим фактором. [c.14] Желательно, чтобы амфолиты были равномерно распределены по всему градиенту pH. Особенно это важно в области нейтральных значений pH во избежание образования там слоя чистой воды. Если такой слой возникает, то в силу его малой электропроводности произойдут сильный разогрев и искажение соседних участков градиента pH за счет усиленной диффузии. Кроме того, в слое чистой воды сконцентрируется практически все напряжение источника тока, так что фокусирующий эффект градиента в целом окажется очень малым. [c.15] Описанная ситуация особенно легко может возникнуть при использовании смесей амфолитов, обеспечивающих рабочий градиент pH целиком в кислой или щелочной областях, т. е. не перекрывающий нейтральных значений pH. В этих случаях на границе градиента, в зоне перехода от амфолитов к като- или анолиту, pH неизбежно должно пройти через значение 7, так что может образоваться слой чистой воды. Ввиду этого при составлении кислой или щелочной рабочей смеси амфолитов нередко добавляют в небольшой концентрации еще и амфолиты для нейтральной области pH (6—8). Они заполняют участок перехода от рабочего градиента к одному из электролитов. При этом каким-то участком рабочего объема приходится пожертвовать, но если концентрация нейтральной смеси амфолитов невелика, то и участок этот будет небольшим. В последние годы сами фирмы-производители из предосторожности стали добавлять в смеси амфолитов для кислых и щелочных диапазонов pH необходимые количества нейтральных амфолитов, не указывая этого в маркировке смеси. Тем не менее, опасности появления слоя чистой воды не следует упускать из виду, особенно если путем электрофокусирования отбирают амфолиты для более узкого, чем продажный, диапазона значений pH (см. ниже). [c.15] Наряду со смесью амфолитов, обеспечивающей формирование градиента pH на весь биохимически интересный диапазон (pH 2,5—10), с целью более тонкого разделения белковых полос фирмы выпускают и смеси амфолитов для относительно узких (шириной в 1,5—3 единицы), перекрывающихся между, собой интервалов pH (2,5—4 3,5—5 4—6 5—8 и т. д.). Смеси сервалитов в интервале pH 4—5,5 выпускаются даже для долей этого интервала шириной всего в 0,5 ед. pH. Следует иметь в виду, что эти интервалы указываются для ИЭФ в градиенте сахарозы. При использовании амфолитов для ИЭФ в геле какая-то доля щелочного участка указанного в маркировке интервала pH за счет эндосмоса неизбежно уходит из геля к катоду, поэтому следует готовить и использовать смеси продажных амфолитов, как это будет рекомендовано ниже. [c.16] Амфолиты, обеспечивающие широкий интервал pH, удобны для исследования сложных смесей белков с неизвестными значениями р1, тогда как амфолиты с узким интервалом — для тонкого фракционирования белков с близкими и приблизительно известными значениями р1. Амфолиты выпускаются в продажу в виде концентрированных 30- или 40%-ных стерильных водных растворов, а наиболее кислые или щелочные смеси ввиду их повышенной электропроводности — чаще в виде 20%-ных растворов. При составлении рабочих градиентов pH и .. азбавляют до оптимальной концентрации (1—2%). [c.16] В некоторых случаях линейный характер градиента pH не является оптимальным — например, когда в одном опыте желательно отделить все не интересующие исследователя белки, не заботясь об их фракционировании, но одновременно провести тонкое разделение белков, лежащих в определенном узком диапазоне pH. Для этой цели удобен градиент с площадкой (рис. 6). Из рисунка видно, что в интервале pH 7—8 градиент пологий — растянут на большую часть длины геля или колонки. Такую форму градиента нетрудно получить, если к раствору с умеренной (0,5—1%) концентрацией амфолитов широкого диапазона pH добавить в такой же или большей концентрации амфолиты для интересующего интервала pH. Благодаря своей повышенной (суммарной) концентрации амфолиты добавленного интервала оттеснят другие амфолиты к краям градиента, куда в процессе ИЭФ отойдут и ненужные белки. В то же время для представляющих интерес белков будут созданы условия тонкого фракционирования в пологом градиенте pH. Отметим попутно, что н сами белковые полосы в пологих градиентах pH оказываются шире, что практически не очень мешает их разделению, но позволяет увеличить загрузку градиента белком. [c.17] Некоторые физико-химические особенности современных амфолитов для ИЭФ не позволяют пока считать их вполне совершенными в отношении функций, которые они выполняют. Желательно, например, чтобы амфолиты максимально отличались от белков по способу окраски, легкости отделения и др. Подробно изучены в этом плане амфолины фирмы LKB . Оказалось, что они окрашиваются нингидрином и многими красителями для белков правда, ниже приведены рецепты красителей, позволяющих в значительной степени обойти это затруднение. Молекулярная масса амфолинов ограничена, как указывалось, в основном интервалом в 300—900 дальтон, что позволяет отделить их от сфокусированных белков после опорожнения колонки или элюции из геля с помощью гель-фильтрации, диализа или высаливания. Однако, хотя и в небольшом количестве, среди амфолинов имеются молекулы с массой 20—30 тыс. [c.18] Токсичностью по отношению к белкам амфолины не обладают. По-видимому, никаких комплексов с белками они не об-i разуют. [c.18] Это явление характерно для всех процессов фракционирования молекул в гелях под действием электрического поля, в том числе и для ИЭФ. Суть его заключается в том, что с неподвижной матрицей геля всегда связано некоторое количество заряженных (чаще всего отрицательно — остатки кислот) ионогенных групп. Их соответствующие противоионы (катионы) находятся в растворе. Под действием электрического поля они мигрируют к катоду, понемногу увлекая за собой и жидкость, находящуюся внутри геля. На смену им приходят катионы из анодного электролита. Вместе с жидкостью в направлении катода дрейфует и весь градиент pH, постепенно выходя из объема трубки или пластины. Ввиду длительности процессов ИЭФ этот катодный дрейф может существенно сместить картину распределения белков, а некоторые ближайшие к катоду полосы могут быть и вовсе утрачены. Кроме того, наиболее крупные, медленно мигрирующие молекулы белков могут не успевать следовать за смещением градиента, так что их полосы будут размазываться. Явление эндосмоса сильнее выражено в щелочной области pH, где в полной мере проявляют себя связанные с матрицей отрицательные заряды. [c.19] Заметим еще, что для ИЭФ, особенно после установления градиента pH н соответственного снижения электропроводности, характерны более высокие значения напряженности электрического поля, чем для электрофореза. Между, тем, явления эндосмоса выражены тем сильнее, чем выше напряженность поля. Следует также иметь в виду, что эта напряженность вследствие различия электропроводности разных амфолитов (см. выше) оказывается неодинаковой в разных участках градиента. Отсюда следует, что и течение жидкости в результате эндосмоса будет неравномерным вдоль градиента. Из областей повышенной напряженности поля жидкость будет вытекать быстрее, чем поступать в них из соседних областей, где напряженность поля ниже и эндосмос выражен слабее. Это может привести к обсыханию некоторых областей геля и переполнению других. Обсыхание влечет за собой дальнейшее увеличение сопротивления, напряженности поля и эндосмоса. В конечном счете могут развиться существенные искажения градиента pH. [c.19] Ввиду изложенного, забота о снижении эндосмоса — важный момент проведения ИЭФ белков. В первую очередь, это накладывает определенные ограничения на используемые для образования гелей материалы, как это более подробно рассмотрено ниже. [c.19] Преимущества использования для ИЭФ тонких горизонтальных пластин геля столь очевидны, что достаточно их перечислить без всяких комментариев. Вот важнейшие из них. [c.20] В отличие от электрофореза объемы электродных буферов (электролитов) при ИЭФ желательно свести до минимума. С одной стороны, опасность изменения pH электролитов в результате электролиза из-за небольшой силы тока невелика. С другой стороны, возникновение конвекционных токов жидкости в объемах электродных резервуаров может вызвать нарушение установившихся градиентов pH между электродами и гелем. Поэтому при ИЭФ в горизонтальных гелях объем электродного резервуара сводится к объему жидкости, смачивающей одну или несколько полосок фильтровальной бумаги. Эти полоски накладывают прямо на поверхность геля, и к ним прижимают по всей длине платиновую проволоку или угольный электрод. [c.20] Приготовление смеси мономеров акриламида производят точно так же, как для электрофореза. Те же соображения и рекомендации остаются в силе для подбора концентраций инициирующих добавок — персульфата аммония или рибофлавина. [c.20] Вносить в смесь ТЕМЭД нет необходимости, так как амфолиты сами играют роль катализаторов полимеризации. [c.21] Вернуться к основной статье