ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Синтез и свойства полимер-белковых конъюгатов и сшитых белков из "Физиологические активные полимеры" Существует несколько стратегических подходов к синтезу водорастворимых полимерных производных белков (рис. 5.1). Первый и наиболее распространенный подход заключается в ковалентном связывании белка с водорастворимым функциональным полимером. По замыслу эта стратегия аналогична той, которой придерживаются при иммобилизации белков на нерастворимых носителях, однако переход к растворимым конъюгатам и необходимость последующего их введения в организм вызывает дополнительные проблемы. Как белок, так и полимер-носитель являются полифункциональными реагентами. Поэтому трудно (хотя все же возможно) избежать многоточечного связывания этих полимеров друг с другом. В некоторых случаях, правда, процесс многоточечного связывания даже желателен, так как приводит к закреплению конформации белка и повышению его устойчивости к действию внешних факторов [5]. Однако не всегда закрепление конформации положительно отражается на каталитической активности фермента. Ряд белков меняет конформацию в ходе функционирования (например, гемоглобин), и в этом случае жесткое закрепление какой-либо определенной структуры нецелесообразно. [c.160] В то же время рассматриваемый подход относительно прост химически и при удачном использовании обеспечивает реализацию полезных свойств полимер-белковых конъюгатов, перечисленных выше. Если исходный белок достаточно биологически активен и наличие балласта в виде полимера-носителя несущественно, то этот подход может быть рекомендован благодаря своей простоте и достаточной изученности. Большинство из описанных ниже полимерных производных ферментов синтезированы именно взаимодействием полимера с белком. В их числе стрептодеказа — первый выпускаемый отечественной промышленностью полимер-ферментный препарат для тромболити-ческой терапии. [c.162] Для связывания с белком водорастворимый полимер должен иметь группы, способные взаимодействовать с функциональными группами белка в условиях, не вызывающих денатурацию последнего. В подавляющем большинстве случаев это реакции в водных растворах при pH = 6—8, реже 3—10. Химические методы при этом в основном те же, что применяются при иммобилизации ферментов [6], а также для связывания с полимером низкомолекулярных ФАВ. В белке для взаимодействия с полимером-носителем используют главным образом аминогруппы. Участие в реакции тиольных групп не всегда желательно, так как их в белках немного и они часто существенны для физиологической активности. Белок может быть предварительно обогащен тиольными группами, например обработкой Ы-ацетил-гомоцистеинтиолактоном, после чего его связывают с полимером. Карбоксильные и ароматические группы белка используются редко, так как в первом случае приходится активировать белок, после чего возникает возможность его сшивания, а во втором — нередко наблюдается снижение физиологической активности белка из-за изменения структуры его гидрофобных областей. [c.162] Второй подход к синтезу растворимых полимер-белковых конъюгатов также заключается в связывании белка с полимером, но не по боковым функциональным группам, а по одной из концевых [7]. В качестве полимера используют активированные (например, трихлортриазином) производные моноэфиров полиэтиленгликоля. Образующиеся конъюгаты имеют звездообразную структуру и не содержат сшивок. Число и длина привитых цепей легко регулируются. Если цепей достаточно много (например, около 10 на молекулу белка), то прививаемый полимер может иметь низкую М ( 10 тыс.) и не подвергаться биодеструкции в организме. Закрепления конформации белка при этом способе не происходит. [c.164] Третий подход к синтезу полимер-белковых конъюгатов заключается в превращении белка в макромономер в результате введения в него двойных связей, обычно по аминогруппам [8]. Макромономер сополимеризуют с низкомолекулярным гидрофильным мономером, формируя таким образом оболочку полимера-носителя вокруг белковой глобулы. Этот подход разработан Н. А. Платэ с сотр. и позволил получить как широкий круг гидрогелей, содержащих функционально активные белки, так и водорастворимые полимер-белковые конъюгаты. В зависимости от числа двойных связей в макромолекуле и ряда других факторов можно регулировать М водорастворимых конъюгатов, а также пористость, набухаемость и другие характеристики гидрогелей. [c.164] Полимер-белковые конъюгаты можно получать и на основе нестехнометрических полиэлектролитных комплексов, содержащих белок [12]. В отличие от стехиометрических поликомплексов нестехиометрические растворимы в воде. Это — шестой подход к синтезу полимер-белковых конъюгатов. [c.165] В качестве полимера-носителя в конъюгатах можно использовать не только небелковый полимер, но и белок. Получают такие конъюгаты контролируемым сшиванием белковых макромолекул низкомолекулярными бифункциональными реагентами. Последние могут быть гомо- или гетерофункциональньши, т. е. иметь одинаковые или разные реакционноспособные группы по концам молекулы. [c.165] Реакции между белком и активированным полимером-носителем или сшивающим реагентом в растворе за редким исключением протекают как взаимодействие полифункциональных полимеров. Поскольку ММР конъюгата определяет сроки его циркуляции, степень поглощения клетками печени и некоторые другие свойства, то желательно иметь возможность регулировать этот параметр. Наличие большого числа сшивок может создать препятствия для биодеструкции полимера-носителя декстран быстро гидролизуется глюкозидами, а Сефадекс медленно, сшитые белки медленнее перевариваются в лизосомах. Важнейшую роль играет степень сохранения функциональных свойств белка. При техническом применении иммобилизованных ферментов необходима только экономически оправданная степень сохранения их активности, причем изменения pH оптимума и других характеристик могут быть компенсированы изменением условий ферментативной реакции. Биомедицинское применение полимер-белковых конъюгатов оставляет мало возможностей для подобной компенсации, хотя в последнее время предпринимаются усилия в этом направлении (создание микроокружения белка за счет заряженных функциональных групп полимера-носителя [16]). Заряд конъюгата в целом и полимера-носителя, находящегося на периферии молекулы, оказывают особенно существенное влияние на прохождение конъюгата или его частей через почки известно, что полианионы удерживаются почками сильнее, чем нейтральные макромолекулы тех же размеров [17]. Поликатионы изменяют скорость эндоцитоза [18]. [c.166] Поведение полимерных производных белков в организме изучено пока что слабо. Неясно еще окончательно, каковы должны быть эффективные размеры молекул конъюгатов, чтобы замедлить фильтрацию их через почки и в то же время избежать быстрого поглощения клетками печени. Очевидно, что на эти размеры влияют общий и поверхностный заряд конъюгата, а также жесткость полимерной оболочки, поскольку последняя не только экранирует белковую глобулу, защищая ее в ряде случаев от макромолекулярных ингибиторов и иммунологического узнавания , но и препятствует взаимодействию с макро-молекулярными субстратами. Необходимо какое-то оптимальное решение, которое позволило бы получать частично защищенные конъюгаты с заметной активностью, например, в отношении лизиса тромбов и других крупных субстратов. Изучение фармакокинетики полимерных конъюгатов с помощью радионуклидов, технически возможное уже в настоящее время, должно помочь в решении этих задач. [c.167] Вернуться к основной статье