ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Регулируемая экспрессия вирусных генов из "Гены и геномы Т 2" В основе регуляции экспрессии генов вирусов млекопитающих лежат те же принципы, что и в основе регуляции экспрессии клеточных генов. Как и промоторы большей части эукариотических генов класса II, промоторы вирусов состоят из проксимальных регуляторных элементов, как правило, входящих в последовательность, непосредственно окружающую точку начала транскрипции и простирающуюся до пары оснований- 100, и дистальных регуляторных элементов, чаще всего расположенных между парами оснований —100 и —300, которые обеспечивают экспрессию гена, специфичную для данной ткани или данной стадии развития организма (рис. 8.27). Регуляторные последовательности, находящиеся внутри единицы транскрипции или за ней, насколько известно, не входят в состав вирусных промоторов. [c.48] Здесь мы детально рассмотрим две системы транскрипции вирусов, которые были и остаются наиболее информативными 1) транскрипция ранней области генома SV40 и 2) транскрипция гена тимидинкиназы вируса герпеса (HSTK). [c.48] Связанный в сайте Т2 Tag работает как АТР-за-висимая геликаза, которая в комплексе с клеточной ДНК-праймазой и ДНК-полимеразой (а возможно, и с другими белками) способствует инициации синтеза новых цепей ДНК. Не исключено, что АТ-и ОС-богатые элементы влияют на репликацию сами по себе благодаря своей близости к стартовой точке с другой стороны, их влияние может быть связано с тем, что повыщение частоты инициации транскрипции в этой области содействует началу репликации. [c.49] Положение и организация промоторов ранней и поздней областей генома 5 /40. В верхней части рисунка изображена геномная ДНК 8 /40 с указанием последовательностей, ответстввнных за регуляцию репликации, е также транскрипции ранней и поздней областей. Стрелками показвны направления транскрипции ранней и поздней областвй и сайты, в которых она начинается. [c.50] В нижней части рисунка указаны сайт начала репликации ДНК (ori), два элемента базального промотора (АТ-бокс и повторы из 21/22 п.н ), а также тандемные повторы длиной 72 п.н. в составе энхансера. Т,, Tj и Тд-места связывания Т-антигена по своему сродству к антигвну они убывают в следующем порядке Т, Tj Tj. [c.50] Мутационный анализ сегмента длиной 72 п.н. и последовательности, фланкирующей его слева, показал, что эта область протяженностью примерно 90 п. н. СОСТОЙ из субэлементов нескольких разных типов (рис. 8.29). Как правило, по отдельности эти субэлементы-слабые стимуляторы, но, действуя вместе в разных сочетаниях, они обеспечивают высокий уровень транскрипции. [c.51] Для эффективной транскрипции ранней области необходимы G -богатые элементы размером 21/22 п.н. и левый сегмент длиной приблизительно 90 п.н однако их ориентация относительно друг друга и сайтов начала транскрипции несущественна. Так. весь повтор из 21/22 п.н. может быть инвертирован без снижения эффективности транскрипции. Точно так же левый элемент размером 72 п.н. стимулирует правильную инициацию транскрипции, находясь в любой ориентации. В то же время, в отличие от повтора из 21/22 п.н., который функционирует только в том случае, когда он находится на своем обычном месте, положение сегмента из 72 п. н. не играет роли. Транскрипция ранней области начинается в правильном месте с нормальной эффективностью, даже если этот сегмент перемещен в интрон ранней области или на сотни и даже тысячи пар оснований вправо или влево от единицы транскрипции и находится в любой ориентации. Однако важно отметить, что сам по себе элемент из 72 п.н. не стимулирует транскрипцию, как и в том случае, если он и элемент из 21/22 п.н. содержатся в разных молекулах ДНК. [c.51] ОНИ разделены сотнями и тысячами пар оснований, в том случае, когда они находятся на близком расстоянии друг от друга, существуют положения, в которых их действие оптимально. Так, если эти повторы разделены короткими сегментами ДНК, соответствующими по длине какому-то числу полных витков спирали ДНК (на один виток приходится 10 п.н.), то активность транскрипции изменяется незначительно. Если же разделяющие участки соответствуют по длине нечетному числу полувитков спирали (например, 5 или 15 п.н.), то активность транскрипции понижается (рис. 8.30). Влияние вставок между повторами размером 21/22 п. н. и АТ-бо-гатым сегментом длиной 17 п.н. зависит от их длины наблюдаемые эффекты весьма сложны и различаются для разных сайтов инициации транскрипции. Эти данные свидетельствуют о том, что эффективность транскрипции зависит от стереоспе-цифических соответствий между повторяющимися последовательностями длиной 21/22 п.н., элементами в составе сегмента размером 72 п. н. и другими последовательностями, расположенными вблизи сайта инициации транскрипции. Соблюдение этих соответствий необходимо для присоединения специфических белков к различным элементам взаимодействия между белками важны для инициации транскрипции и зависят от их правильной взаимной пространственной ориентации. [c.52] Энхансер - это наиболее сложный элемент, участвующий в регуляции транскрипции SV40 (рис. 8.29). Он состоит из нескольких различающихся коротких элементов, расположенных в пределах повтора длиной 72 п. н., и примыкающего к нему слева участка из 25 п. н. Каждый элемент сам по себе обладает очень низкой энхансерной активностью. Точная идентификация элементов энхансера осложняется тем, что их активность можно оценить только по их влиянию на транскрипцию у определенного хозяина и в отдельном опыте. Некоторые элементы вносят примерно одинаковый вклад в общую активность энхансера независимо от хозяина или системы транскрипции, а другие функционируют только в определенных клетках. Кроме того, мутации в ка-ком-нибудь из этих элементов обычно понижают активность энхансера в 5-10 раз, в то время как при делеции всего энхансера эффективность транскрипции уменьшается в сотни раз. Это говорит о том, что энхансер включает большое число сигнальных последовательностей и каждая из них вносит вклад в его суммарную функциональную активность. Не исключено, что степень и характер этой избыточности имеют реальное физиологическое значение, которое пока не удалось установить. [c.53] Три элемента энхансера, Р, Sph и октамер (o ta), образуют один домен (А), а спаренные GT- и ТС-элементы-второй (В). Эти домены могут быть инвертированы относительно друг друга или могут находиться один от другого на расстоянии до 100 п. н. без заметного снижения активности энхансера. Однако делеции в Sph или в октамере А-доме-на либо ОТ- и ТС-элементах В-домена снижают активность энхансера, причем степень этого снижения зависит от того, в каких именно клетках измеряется активность транскрипции. Элемент Р несуществен для функционирования энхансера, но в его присутствии транскрипция становится чувствительной к стимуляции форболовыми эфирами-веществами, активирующими клеточную протеинки-назу. [c.53] Полипептидные факторы транскрипции. Большое число факторов, предположительно участвующих в транскрипции ранней области SV40. было выделено из клеточных экстрактов, способных осуществлять транскрипцию с промотора ранней области. Для их идентификации, очистки и изучения применялись разные методы. Некоторые факторы специфически связываются с конкретным элементом, о чем свидетельствует их способность защищать определенные основания в этом элементе от расщепления ДНКазой 1 (футпринтинг разд. 8.2.в), а также уменьшение электрофоретической подвижности ДНК, содержащих такой элемент, при связывании его с белком (смещение полосы). Имеются данные о восстановлении транскрипционной активности в экстрактах, обедненных определенными факторами, при добавлении последних, а также об отсутствии такого восстановления в том случае, когда сайты связывания разрушены. Это указывает на то, что связывание данных факторов активирует транскрипцию. Клонированы и секвенированы гены, кодирующие некоторые факторы транскрипции. Их экспрессия в Е. соН и способность синтезированных продуктов активировать транскрипцию in vitro позволяют идентифицировать важные домены белков. [c.54] Вернуться к основной статье