ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Принципы колоночной хроматографии из "Методы очистки белков" Хроматография основана на том, что растворенные вещества отстают от фронта растворителя по мере его продвижения по носителю. Название хроматография (от греч. hroma — цвет и grapho—пишу) было впервые использовано для описания разделения природных пигментов в результате разной степени их задержки на листе фильтровальной бумаги (рис. 11.6). Этот принцип до сих пор широко используется и может быть назван одномерной хроматографией, так как лист бумаги практически не имеет толщины. Второе измерение появляется при использовании колонки с носителем, что может быть приравнено к стопке из многих полосок бумаги, как показано на рис. 1.6, S. Теперь образец на старте представляет собой диск или цилиндр, а не тонкую линию. По мере прохождения растворителя по колонке вещества, содержащиеся в образце, распределяются следующим образом. Вещества, полностью извлеченные растворителем, движутся вместе с фронтом растворителя ( /=1) и очень быстро вымываются. Вещества, полностью адсорбированные носителем (/ = 0), останутся на старте. [c.19] Колоночная хроматография —это главный метод разделения ферментов, позволяющий использовать огромное разнообразие адсорбентов. Некоторые адсорбенты обладают очень большой емкостью относительно тех или иных белков ( 100мгХ Хсм 3), тогда как у других адсорбентов емкость может быть в 200 раз меньше указанной. Поэтому размеры колонок, необходимых для разделения, варьируют в широких пределах. Теоретически для идеальной системы форма колонки не имеет значения, так как отношение длины колонки к толщине слоя образца остается неизменным, если объемы адсорбента и образца не меняются (рис. 1.7). Однако размер частиц весьма важен более тонкое разделение белков достигается при прохождении ими большего числа частиц адсорбента, что соответствует большему числу теоретических тарелок. Таким образом, при данном размере частиц адсорбента более длинная колонка имеет определенные преимущества. С другой стороны, в колонке большого диаметра можно использовать более мелкие частицы, так как уменьшение скорости протекания через каждый квадратный сантиметр, обычно неизбежное для таких плотных адсорбентов, компенсируется большим поперечным сечением колонки. На практике, однако, предпочитают использовать более длинные колонки, поскольку идеальные условия работы не соблюдаются, а поток не является достаточно, равноме рным (см. рис. 5.8 и 5.9). Это приводит к увеличению продолжительности процесса, что может быть нежелательным. В лаборатории должны быть колонки разной емкости (от 1 см до 2 л) и разной формы (от коротких, в которых диаметр приблизительно равен высоте, до длинных, в которых диаметр составляет около 1/30 высоты), и всем им находится применение. [c.21] Самые лучшие колонки снабжены специальными устройствами для выравнивания верхней и нижней поверхностей носителя, так что равномерный поток жидкости, протекающей вниз по колонке, не нарушается на ее концах. Эффективная пористая сетка или диск на дне колонки дают возможность раствору свободно вытекать в сборное пространство, которое должно иметь. минимальный объем, так как это уменьшает смешивание фракций. Для этой же цели во время нанесения образца и последующей элюции буферные растворы следует очень ровно распределять по поверхности носителя (рис. 1.8). [c.22] В учебной лаборатории, где работают десятки студентов, по экономическим соображениям невозможно снабдить каждого из них такой колонкой. При работе с малыми объемами можно использовать такие простые и дешевые системы, как пастеровская пипетка с тампоном из стеклянной ваты в месте сужения трубки (рис. 1.9, Л), шприц с поршнем или без него, имеющий на дне перфорированный пластиковый диск (рис. 11.9, Б), или простая стеклянная трубка с резиновой пробкой, вставленной в один из ее концов, и каким-либо фильтром типа пористого диска или слоя фильтровальной ткани, обеспечивающим равномерный сбор элюата (рис. 1.9, 5 . Неравномерный ток жидкости на поверхности носителя может быть причиной ее неравномерного протекания через колонку. Небольшой слой жидкости над адсорбентом позволяет устранить все эти нарушения, если адсорбент представляет собой хорошо уплотняющийся материал и его поверхность не повреждается при перемещении над ней буфера несколько примеров неравномерного протекания жидкости через колонку показано на рис. 1.10. Так как большинство белковых растворов бесцветны, часто не обращают внимания на тс, что колонка работает плохо. [c.22] В идеальном случае колонку следует заполнять адсорбентом за один прием при постоянном перемешивании суспензии, как показано на рис. 1.11. Короткие колонки удобно заполнять густой суспензией, в которой на 1 объем адсорбента приходится не более 1 объема буфера. При этом частицы быстро оседают благодаря тому, что жидкость свободно вытекает из колонки через открытую выходную трубку. После набивки колонки необходимо пропустить через нее несколько объемов буфера для уравновешивания это особенно важно при работе с ионооб-менниками в этом случае pH суспензии адсорбента в буфере должен быть доведен до нужной величины еще перед набивкой колонки. [c.24] Протекание жидкости через колонку может осуществляться под действием силы тяжести если давление водяного столба высотой около 1 м не дает достаточно быстрого потока, значит, система, вероятно, частично блокирована или используемые трубки слишком тонки и создают большое сопротивление. Широко применяемые перистальтические насосы, с помощью которых можно поддерживать постоянную скорость протекания буфера, позволяют размещать образец, буфер и градиентный смеситель на удобном уровне. [c.24] Вернуться к основной статье