ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Некоторые приемы, используемые при работе с белковыми растворами из "Методы очистки белков" В последнем разделе этой вводной главы, посвященной общим методам, приведены некоторые сведения об обращении с белковыми растворами. В гл. 6 обсуждаются специальные методы, позволяющие сохранять стабильность фермента и его активность. Очень часто в распоряжении исследователя бывает раствор белка, который еще непригоден для фракционирования. Он может быть в неподходящем буфере, иметь не то значение pH, содержать слишком много соли, быть слишком разбавленным или слишком мутным. Мутность указывает на наличие нерастворимых частиц, которые можно отцентрифугировать ил отфильтровать, как описано в разд. 1.2. Значение pH можно легко изменить с помощью рН-метра, добавляя к раствору не очень сильную кислоту или щелочь (разд. 6.1). Концентрирование растворов и способы замены буферов описаны в данном разделе более подробно. [c.26] Концентрированные растворы можно легко разбавить, однако обратный процесс ограничивается условиями, налагаемыми вторым законом термодинамики. Концентрировать растворы белков можно по-разному выбор наилучшего способа зависит от особенностей применения концентрируемого белка и предъявляемых к нему требований. Концентрирование можно проводить путем осаждения белкового раствора с последующим растворением осадка в меньшем объеме. Обычно при этом используют сульфат аммония, хотя иногда применяют и ацетон (разд. 3.4). Растворенный осадок содержит осадитель, который необходимо удалить. Методы осаждения пригодны только для растворов, содержащих белки в концентрации выше 1 мг/мл белки в более низкой концентрации или не осаждаются, если их растворимость недостаточна низка, или денатурируют в про- цессе агрегации. Однако из этого последнего правила существует много исключений, так как некоторые белки в разбавленном растворе обладают по сравнению с другими более высокой стабильностью. [c.26] ПОЛНОСТЬЮ, неважно, адсорбируются ли при зтом другие белки). Например, очень разбавленный белковый раствор, элюированный с ДЭАЭ-целлюлозы при низкой ионной силе и pH 6, можно адсорбировать на маленькой колонке с ДЭЛЭ-целлюло-зой, повысив pH раствора до 8, а затем элюировать белок небольшим объемом солевого раствора. [c.27] ДО 5 мл или с 200 до 10 мл в течение 1 ч и даже быстрее. Ультрафильтрация особенно эффективна, если конечная концентрация белка остается относительно низкой. Скорость ультрафильтрации очень быстро падает с повышением концентрации белка. [c.28] Для быстрого концентрирования можно использовать сухой гель-фильтрующий материал, который при набухании исключает белок. Так как невозможно удалить весь белковый раствор с поверхности частиц без промывания (приводящего к разбавлению), этот метод пригоден лишь в тех случаях, когда более важное значение имеет концентрация раствора, а не выход белка. В лучшем случае можно ожидать, что потери белка составят 10—15%- Например, при обработке 100 мл раствора 20 г сухого сефадекса 0-25 порошок быстро набухает и поглощает воду, занимающую практически весь объем геля. После отса-сыванпя набухшего геля получают около 30 мл раствора, содержащего около 80% исходного белка, сконцентрированного приблизительно вдвое. Это весьма удобный метод, если необходимо быстро сконцентрировать уже концентрированный раствор, однако при очистке ферментов он обычно не применяется из-за потерь белка. [c.28] Еще один метод концентрирования состоит в удалении воды за счет осмотических сил. Образец помещают в диализный мешок, который затем погружают в раствор или порошок, оттягивающий воду из мешка. Обычно для этого используют поли-этиленгликоль (мол. масса 20 ООО) или высокозамещенную карбоксиметилцеллюлозу. Оба этих полимера очень сильно поглощают воду, поддерживая низкую активность воды снаружи мешка и высокую внутри. Фирма СаШюсЬет выпускает эти вещества под названием Aqua ide . Они очень удобны при работе с небольшими объемами в течение 1 ч раствор объемом 10 мл можно сконцентрировать практически досуха, обсыпая диализный мешок порошком и периодически удаляя с его поверхности гидратированный гель. При работе с большими объемами можно использовать концентрированный раствор поли-этиленгликоля (например, 20%-ный). Диализный мешок оставляют в этом растворе при постоянном перемешивании на несколько часов. Метод можно считать вполне удовлетворительным при условии, что полимеры не содержат низкомолекулярных примесей, вредных для фермента. [c.28] ТО в лучшем случае можно достигнуть 51-кратного разбавления исходного материала, содержащего соли и другие низкомолекулярные вещества. Следовательно, необходимо хотя бы один раз сменить буфер. Для ускорения процесса следует перемешивать буферный раствор и перемещать в нем диализный мешочек. В хорошо перемешиваемой системе уравновешивание более чем на 90% происходит за 2—3 ч. Лучше использовать большой объем буфера, так как при этом реже придется его менять (табл. 1.1). Если не требуется принимать особых предосторожностей, то диализ удобно проводить в течение ночи к утру обычно достигается равновесие. Однако во время диализа может происходить протеолитическое расщепление белка (см. раздел 7.1), что ограничивает применение этого метода. [c.30] Существуют способы предварительной обработки диализных трубок для удаления из них различных химических веществ,, внесенных в процессе производства. Диализные трубки рекомендуется кипятить в растворе ЭДТА—МаНСОз. Длительное хранение их в этом растворе также дает хороший результат. Проблема химического загрязнения белка возникает только тогда, когда нужно провести диализ очень разбавленного белкового раствора, так как в этом случае соотношение между площадью поверхности мембраны и количеством белка будет высоким. Белковые растворы с концентрацией порядка 10 мг-мл- и более при взаимодействии с мембраной, вероятно, не изменяются на практике сухие диализные трубки можно спокойно использовать без какой-либо предварительной обработки. После увлажнения трубки на одном ее конце завязывают один или лучше два узла, а в другой конец вставляют воронку, через которую в мешок наливают раствор образца. Его удобно наливать, когда один конец диализного мешка лежит на какой-либо плоскости (рис. 1.14). Лучше всего перед тем, как наливать образец в мешок, положить его на плоскую поверхность так, чтобы через воронку не выходил воздух. Затем мешок завязывают с другого конца и помещают для диализа в буфер. В мешке необходимо оставить свободное пространство в расчете на увеличение объема, если концентрация растворенных в образце веществ высока. В противном случае при увеличении объема раствора мешок набухнет и давление внутри мешка сильно возрастет. Это может привести к разрыву мембраны или вытеканию раствора через узлы. [c.31] До широкого внедрения в практику метода гель-фильтрации диализ был рутинной стандартной процедурой, почти всегда применявшейся при очистке белков. Хотя этот метод отличается простотой и не требует сложного оборудования, он имеет два больших недостатка необходимость замены диализата, причем часто в неудобное время, и относительную длительность процедуры. Вопрос о том, насколько важно проводить все операции достаточно быстро, обсуждается в разд. 7.1. За исключением тех случаев, когда диализ ставят на ночь, т. е. в то время, когда другие работы, как правило, не выполняются, во всех остальных случаях использование гель-фильтрации оказывается предпочтительным. Этим методом достигается быстрое и полное разделение белков, особенно при работе с небольшими объемами. [c.31] Как и в случае диализа, конечный объем белкового раствора, вероятно, будет значительно больше, чем до обессоливания тем не менее перед нанесением образца на адсорбционную колонку может потребоваться дальнейшее разведение (гл. 4). Смена буферов может быть осуществлена тем же способом, что и обессоливание однако, если концентрация белка в растворе низка и объем достаточно велик, лучше предварительно провести высаливание белка, а затем растворить его в небольшом объеме буфера и обессолить на небольшой колонке. [c.33] В этой главе описаны основные приемы, используемые при очистке ферментов. В гл. 3, 4 и 5 подробно рассматриваются методы фракционирования, применяемые для выделения ферментов. Но прежде чем приступить к дальнейшей работе, необходимо приготовить экстракт исходного материала получение этого экстракта описывается в следующей главе. [c.33] Вернуться к основной статье