ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Оптимизация и осветление экстракта из "Методы очистки белков" До сих пор мы не говорили о природе экстрагирующего буфера, за исключением того, что для определенных целей он должен содержать вещества типа р-меркаптоэтанола. Для экстракции можно использовать и воду, но она экстрагирует не все белки. Было бы замечательно, если интересующий нас фермент полностью экстрагировался бы водой. Клетки содержат разные соли и много нерастворимого, несущего заряд материала — белки, фосфолипиды, нуклеиновые кислоты. Ионная сила в цитоплазме типичной клетки колеблется в пределах 0,15—0,2 М. В этих условиях цитоплазматические белки растворимы в том смысле, что они могут перемещаться в клетке. При гомогенизации клеток с 2—3 объемами воды ионная сила гомогената может снизиться до 0,05 и ниже. В этих условиях заряженные частицы в растворе могут действовать в качестве ионообменни-ков и адсорбировать белки, особенно основные. [c.47] После разрушения клеток в соответствующем буфере желательно проверить pH гомогената. Хотя после гомогенизации действительно свежего материала в буфере гомогенат имеет тот же pH, что и буфер, это значение может снизиться вследствие метаболических процессов, ведущих к закислению среды. Хорошим примером могут служить скелетные мышцы, в которых гликоген быстро превращается в молочную кислоту, и pH гомогената может упасть с 7,0 до 6,0 за 30—60 мин (включая время центрифугирования). В таких случаях перед центрифугированием значение pH можно поднять выше нужной величины (например, 1 М трис-буфером). Кроме того, добавление ингибитора гликолиза может остановить процесс. Для этой цели иногда используют фторид (10—30 мМ). [c.48] Эти общие замечания относятся к улучшению условий экстракции всех растворимых компонентов. При экстрагировании J aкoгo-тo одного фермента лучше использовать другие условия, лри которых не происходит полной солюбилизации всех компонентов, тогда как нужный фермент экстрагируется полностью. [c.48] Теперь рассмотрим различные типы экстрактов. При работе с некоторыми животными тканями частицы составляют незначительную часть экстракта и ими можно пренебречь. Они агрегируют, скажем, при первом же фракционировании сульфатом аммония и затем удаляются. С другой стороны, есть животные ткани, содержащие больше жиров и мембранных структур при экстрагировании таких тканей образуются суспензии. Подкисление среды до pH 6,0—5,0 обычно приводит к агрегации материала, который можно затем отцентрифугировать при относительно низкой скорости. Рибосомы и другие нуклеопротеиды обычно удаляются при подкислении, которое можно рассматривать как одну из форм изоэлектрического осаждения (разд. 3.2) фосфатные группы протонируются и нейтрализуют или по крайней мере снижают заряд частиц суспензии. Этот способ дает очень хорошие результаты при условии, что нужный фермент г) не осаждается изоэлектрически при данном значении pH, б) не адсорбируется на образовавшемся осадке или в) остается стабильным при нефизиологических значениях pH. Экстракт охлаждают и снижают pH соответствующей кислотой (например, 1 М уксусной, разд. 6.1). После перемешивания в течение 10—20 мин осадок отделяют центрифугированием, а pH надосадочной жидкости доводят, если необходимо, до нужного значения перед тем, как приступить к первому этапу фракционирования. Растительные ткани отличаются прежде всего тем, что реакция среды в них более кислая и содержащиеся в них частицы, такие, как фрагменты хлоропластов, агрегируют значительно труднее. К тому же растительные экстракты содержат сравнительно мало корпускулярного материала, если не считать грубых частиц типа зерен крахмала, которые легко осаждаются после приготовления экстракта. [c.49] После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80%-ном насыщении сульфатом аммония (разд. 3.3) или 55%-ной концентрации ацетона (разд. 3.4). В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования. [c.50] Приготовление экстрактов из дрожжей связано с несколькими проблемами. Главная из них состоит в том, что клеточные стенки у грибов очень толстые и их трудно разрушить. Поэтому для получения экстракта требуются более эффективные методы. Если экстракт нужно получить быстро, единственный надежный способ — это применение вибрационной шаровой мельницы или гомогенизатора Мэитона — Гаулина. При использовании этих методов образуется большое количество частиц низкой плотности, которые не полностью удаляются центрифугированием. Мутность может снизить эффективность осаждения белка сульфатом аммония. Однако ее можно устранить путем агрегации частиц в органическом растворителе (ацетон, 20— 25% по объему при 0°С). В прозрачном растворе остается большинство ферментов, которые осаждаются при повышении концентрации ацетона (разд. 3.4). Прозрачные экстракты получают также, используя автолиз толуолом, но в этих условиях может происходить протеолитическое расщепление белков. [c.51] Для выделения очень стабильного фермента фосфоглюкому-тазы применяют цитолиз под действием концентрированного аммиака [13]. Эта процедура разработана и широко применяется при работе с активными сухими дрожжами. Ее используют для получения прозрачных экстрактов, содержащих большую часть гликолитических ферментов [18]. Некоторые ферменты полностью разрушаются при высоких значениях pH. При использовании этого метода протеолиз не представляет серьезной проблемы, так как активность протеаз достаточно низка при pH 9,5—10. Эффективность экстракции может значительно варьировать в зависимости от партии дрожжей. [c.51] Теперь можно было бы перейти к обсуждению методов очистки экстракт, содержащий значительную часть фермента, получен, из него удалены частицы и небелковый материал. Но перед тем, как закончить эту главу, следует остановиться на классе ферментов, который не затрагивался в предыдущих разделах. Это нерастворимые ферменты, ассоциированные с частицами. По определению, они отсутствуют в прозрачном экстракте. [c.51] Вернуться к основной статье