ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы, используемые при очистке ферментов, ассоциированных с частицами из "Методы очистки белков" В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52] Другой способ заключается в солюбилизации фермента (субфракционирование, конечно, может предшествовать солюбилизации). Не все ферменты способны существовать в солюбилизированном состоянии, будучи изолированы от их нормального клеточного окружения поэтому успех очистки таких ферментов зависит от того, насколько полно можно отделить фрагменты частиц, содержащие фермент, от прочего корпускулярного материала. [c.52] Фермент, связанный, с частицами, может быть солюбилизирован различными путями. Во многих случаях солюбилизированные ферменты ведут себя в дальнейшем как все водорастворимые ферменты, и их фракционирование может быть проведено с помощью процедур, описанных в гл. 3—5. С другой стороны, иногда возникает необходимость солюбилизировать фермент, используя детергенты. В этом случае детергент, связанный с белком, замещает липидсодержащую мембрану. Если впоследствии детергент удаляют, белок может денатурировать или по крайней мере агрегировать и выпадать из раствора. [c.52] Типичным примером выделения мембраносвязанного фермента без использования детергентов служит получение АТР-азно-ю комплекса из митохондрий сердца быка [21]. Прежде всего выделяют митохондрии с помощью метода, дающего наибольший выход. Затем для высвобождения белков матрикса митохондрии обрабатывают ультразвуком. Значение pH доводят до 9,2 в присутствии ЭДТА и снова проводят озвучивание, после чего большая часть мембранных белков митохондрий переходит в раствор. Активную водорастворимую АТР-азу выделяют из полученного раствора изоэлектрическим осаждением (разд. 3.2) и хроматографированием на ДЭАЭ-сефадексе (разд. 4.3). [c.53] Если белок солюбилизирован и установлено, что его целостность не нарушена, можно провести фракционирование, подобное описанному в следующих главах. В большинстве случаев это не представляет особой проблемы. Необходимо сохранить активность фермента это зависит от выбора подходящего детергента. Неионные детергенты, такие, как тритон Х-100, очень мягки по своему действию, и большинство белков, как связанных с мембранами, так и свободных, выдерживают концентрации тритона Х-100 до 1—3% (вес/ об.) Напротив, некоторые анионные детергенты (например, додецилсульфат) обладают наряду с солюбилизирующими свойствами очень сильным денатурирующим действием. Они, по-видимому, не найдут широкого применения при выделении ферментов. [c.54] Избыток детергента может мешать фракционированию. Например, высаливание сульфатом аммония приводит к появлению на поверхности раствора слоя тритона Х-100, в котором часто содержатся нужные белки. Однако эффективного разделения при этом не происходит. Можно провести колоночную хроматографию или отделить белки с помощью гель-фильтрации (разд. 5.1), но не исключено, что мицеллы детергента будут двигаться в той же зоне, что и белок, и, следовательно, окажутся в одной фракции. Ионообменная хроматография успешно осуществляется в присутствии неионных детергентов (разд. 4.2 и 4.3). Действительно, тритон Х-100 в концентрации до 1% оказывает незначительное влияние на ионообменные свойства нормальных водорастворимых белков. Но солюбилизированные белки мембран могут находиться только в составе детергентных мицелл, что существенно влияет на процесс ионного обмена. Если исследуемый белок удается адсорбировать на ионообменнике, то избыток детергента свободно проходит через колонку. Это позволяет элюировать свободный (относительно) от детергента белок. С другой стороны, если полное удаление детергента приводит к денатурации белка, то, чтобы предотвратить это, в буфер вносят небольшое количество детергента ( 0,1 7о). Собранная фракция будет, конечно, тоже содержать некоторое количество детергента. Тем не менее, так как обычно из смеси белков выделяют какой-то определенный фермент, присутствие в конечном препарате незначительной концентрации чистого детергента, не загрязненного жирами, не принесет большого вреда. Методы удаления избытка детергентов были недавно суммированы в обзоре [23]. [c.55] Исчерпывающее обсуждение методов экстракции водорастворимых ферментов из мембран читатель найдет в другой работе [19]. Белки, связанные с мембранами, очевидно, отличаются по растворимости от типичных цитоплазматических ферментов, и для их очистки иногда применяются (и вполне успешно) некоторые необычные эмпирически найденные методы. [c.55] Вернуться к основной статье