ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Осаждение вследствие избирательной денатурации из "Методы очистки белков" На всем протяжении этой книги неоднократно подчеркивается, что во избежание денатурации белков следует использовать мягкие способы их обработки. Существует целый ряд. очень устойчивых ферментов, выдерживающих экстремальные условия окружающей среды. Эту исключительно высокую стабильность можно использовать, подвергая неочищенный препарат воздействию таких условий. При этом ненужные белки денатурируют и выпадают из раствора в осадок. В процессе денатурации происходит разрушение третичной структуры белковой молекулы и образуются неупорядоченные полипептидные цепи. В растворе они взаимодействуют между собой и агрегируют. Агрегация происходит под действием физических сил и в некоторой степени в результате химических взаимодействий через образование —5—5-связей. Тем не менее при низких концентрациях солей и значениях pH, далеких от изоэлектрической точки, денатурированные белки могут находиться в полностьк растворимом состоянии и осаждаться только при достижении определенного значения pH. Растворимость денатурированных белков может быть обусловлена силами отталкивания между отдельными заряженными пептидными цепями. По мере приближения pH к изоэлектрической точке белки могут претерпевать агрегацию, которой способствует также высокая концентрация соли, снижающая внутримолекулярные силы отталкивания. [c.83] Цель избирательной денатурации состоит в создании таких условий, при которых нужный фермент или совсем не денатурирует, или же потери его составляют не более 10—20%, тогда как множество других компонентов смеси денатурирует и в основном осаждается в результате проведенной обработки. Для избирательной денатурации используют преимущественно 1) температуру, 2) pH и 3) органические растворители. Эти три способа воздействия обычно взаимосвязаны, поскольку денатурация под действием температуры в большой степени зависит от значений pH, и наоборот. При денатурации органическими растворителями необходимо тщательно подбирать температуру, pH и величину ионной силы. Ионная сила может несколько изменять влияние температуры и pH, особенно если сравнивать поведение белков при низкой ионной силе (от 0,01 до 0,1) с их поведением при высокой концентрации соли, например в 1 М растворе сульфата аммония. Эти три типа денатурации рассматриваются ниже. [c.83] На рис. 3.14 представлена теоретическая кривая, позволяющая определить количество белка, денатурировавшего за 10 мин при данной температуре. Кривая построена в предположении, что акт=400 кДжХ Хмоль и что 50%-ная денатурация наступает через 10 мин при 50 °С. Следует отметить, что при температуре лишь на 5 °С выше температуры, соответствующей 50%-ной денатурации, сохраняется не более 1% исходной активности, а при температуре на 5°С ниже указанной утрачивается только 8% активности. [c.85] Разные белки имеют неодинаковую величину акт, и, следовательно, средние точки их кривых денатурации (а также форма кривых) сильно различаются. Поэтому можно подобрать температуру, при которой один белок полностью денатурирует, тогда как другой белок более чем на 95% остается интактным. В группе белков, показанной на рис. 3.15, каждый белок имеет собственную кривую денатурации. Если в этом случае попытаться выделить белок О путем нагревания смеси до 50 °С в течение 10 мин, то белки А и В денатурируют практически полностью, а белок С —лишь в незначительной степени. Белок О сохраняется на 907о, тогда как белки Е и Р совсем не подвергаются денатурации. В зависимости от соотношения данных белков в обрабатываемой смеси этот этап может иметь определенный смысл, особенно если другим способом трудно отделить А или В от О. [c.85] Так же как и в случае многих других эмпирических методов фракционирования, весьма маловероятно, чтобы исследователь, применяющий тепловую денатурацию белков, имел хоть какое-то представление о поведении многих, если не всех, белков, присутствующих в смеси, не говоря уж о таких подробных сведениях, которые даны на рис. 3.15. Однако о поведении определенного интересующего иследователя фермента можно судить, нагревая небольшие пробы при различных температурах с интервалами в 5°С. Время инкубации важно только для получения воспроизводимых результатов инкубация проб в течение 1 или 60 мин даст кривые одинаковой формы, но сдвинутые по оси температур. Тем не менее следует учитывать, что если инкубация в течение 1 мин очень удобна при работе с объемом 1 мл, то почти невозможно за такое короткое время нагреть и быстро охладить большой объем жидкости. Во время нагревания раствора до нужной температуры и последующего ее снижения происходит дальнейшая денатурация. [c.86] Говоря о тепловой денатурации, важно обратить внимание на возможность протеолиза. Протеазы, как и другие ферменты, активируются при повышении температуры. Они обычно довольно стабильны, так что даже в том случае, когда нужный фермент сохраняет активность, вполне может произойти частичное расщепление белка или его небольшая модификация, что неблагоприятно скажется на качестве препарата. Именно по этой причине предпочтительно проводить нагревание в присутствии сульфата аммония (несмотря на то что под влиянием соли белки могут стабилизироваться настолько, что для их денатурации потребуется более высокая температура), поскольку высокие концентрации соли в значительной мере ингибируют протеолиз. Есть также примеры стабилизации фермента его субстратом, однако присутствие субстрата может также и дестабилизировать фермент. [c.86] Для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно контролировать состав буфера, содержащего подвергаемый тепловой обработке образец. Температурная кривая денатурации должна быть воспроизводимой. Помимо всего прочего, необходимо точно знать pH раствора. Как показано в следующем подразделе, незначительное изменение pH может быть, причиной существенной денатурации белка. [c.86] Пробы на тепловую денатурацию следует производить прИ различных значениях pH. Цель в этом случае заключается в том, чтобы получить максимальное осаждение ненужных белков, при заданной, например 90%-ной, степени сохранения активности фермента. Используя экстремальные значения pH, этот результат можно получить при более низких температурах. Теперь этот процесс получил название рН-денатурации. [c.86] Чем больше отличается pH среды от физиологических значе-яий pH для данного фермента, тем менее стабильным оказывается фермент. Однако следует отметить, что это не обяза-телъио происходит при значениях pH, отличных от нейтральных. Например, пепсин достаточно стабилен и имеет нормальную активность при pH 1—2, но быстро денатурирует при pH 7 и выше. Оптимальная стабильность фермента не всегда наблюдается при значении pH, оптимальном для его функционирования, а оптимум pH часто не совпадает с физиологической областью pH. Последнее обусловлено тем, что условия эксперимента, при которых фермент насыщен субстратом, не обязательно соответствуют физиологическим условиям. Тем не менее предполагается, что фермент наиболее стабилен при физиологических или близких к ним значениях pH. [c.87] В разд, 3.4 описано использование органических растворителей для осаждения белков при низких температурах. Чтобы избежать денатурации белков, температура поддерживается около 0°С. В этом разделе речь идет о применении органических растворителей для денатурации. При этом обычно используют температуру от 20 до 30 °С или даже выше концентрация же органического растворителя обычно ниже, чем это требуется для осаждения нативных белков. [c.89] ЛИ ДЛЯ проведения одной из стадий первоначального способа очистки этого фермента [34]. Алкогольдегидрогеназу дрожжей можно очень легко очистить после предварительной обработки экстракта 33%-ным (по объему) этанолом при 25 °С [35]. [c.90] Было исследовано действие спиртов на глицеральдегидфос-фатдегидрогеназу дрожжей (неопубликованные данные). Выяснилось, что чем длиннее алифатическая цепь использованного спирта, тем более сильным денатурирующим действием он обладает (рис. 3.17). Концентрация нормального спирта, необходимого для достижения 50%-ной денатурации за время 30-минутной инкубации при 30 X, снижается в 2 раза при удлинении цепи спирта на одну метиленовую группу. Так, процентная концентрация метанола, этанола, пропан-1-ола, бутан-1-ола, пентан-1-ола, необходимая для денатурации, равна соответственно 34, 17, 8,5, 4,2 и 2,2. Ряд не был продолжен далее из-за того, что спирты с более длинной цепью плохо смешиваются с водой. Спирты с разветвленной цепью обладают меньшим денатурирующим действием (и лучше смешиваются с водой), откуда следует, что важной характеристикой денатурирующих свойств спирта является длина его алифатической цепи. Ацетон дает результаты, сходные с результатами, полученными при обработке этанолом. Итак, чтобы избежать денатурации при осаждении органическими растворителями, лучше использовать метанол. [c.90] Для денатурации органическим растворителем необходимо очень тщательно подбирать pH и температурный режим, так как эти три фактора оказывают совместное действие на белки. Поскольку существует множество различных вариантов, практически невозможно добиться идеальных условий проведения процесса, т. е. таких, при которых максимальное сохранение активности нужного фермента сочеталось бы с максимальным разрушением других белков. С другой стороны, для подбора условий, близких к оптимальным, можно провести много пробных тестов за короткое время с малыми объемами образца. [c.90] Часто приводимым примером осаждения белка органическим растворителем, но на этот раз не смешивающимся с водой, является денатурация гемоглобина хлороформом (ср. [7] и, например [36]). Очистка ферментов эритроцитов осложняется тем, что более 90% общего белка эритроцитов составляет гемоглобин. Встряхивание гемолизата со смесью этанол — хлороформ приводит к полной денатурации гемоглобина. Незначительное количество хлороформа смешивается с водной фазой и оказывает сильное специфическое денатурирующее действие на молекулы гемоглобина. Таким образом, первой стадией выделения эритроцитарного фермента часто служит обработка гемолизата хлороформом, что приводит к удалению основного загрязняющего белка — гемоглобина. [c.90] Вернуться к основной статье