ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Ионообменники принципы, свойства и использование из "Методы очистки белков" К тому же образование трис-С1 приводит к повышению ионной силы буфе)ра, проходящего через колонку. Обычно на каждый 1 мг-мл адсорбированного белка дополнительно образуются соли буфера в концентрации 1 мМ. При высокой концентрации нанесенного образца pH неадсорбированных фракций будет ниже, чем pH предшествовавшего промывочного буфера (или выше, если речь идет о катионообменнике). Для того чтобы избежать этих изменений величины pH и ионной силы, в результате которых адсорбция может быть ниже ожидаемой величины, концентрация наносимого на колонку белка не должна быть слишком высокой — особенно если предполагается, что значительная его часть адсорбируется на колонке. Это означает также, что необходимо использовать растворы, обладающие достаточной буферной емкостью, — в отсутствие буфера могут произойти значительные изменения pH, приводящие к денатурации белка. Обычно используют буфер, минимальная концентрация кото рого составляет 10 мМ при значении pH, отличающемся не более чем на 0,3 единицы от величины его р/Са (см. [c.102] При изменении pH буфера [38]. Расчеты, сделанные на основе этих кривых и уравнений, приведенных в разд. 4Л, позволяют количественно оценить величины констант диссоциации (допуская, что условия приближаются к равновесным) между белком и адсорбентом. В этих работах в качестве адсорбента была использована КМ-целлюлоза. Оказалось возможным не только рассчитать величины а и Кр, но исходя из скорости изменения этих величин в зависимости от pH получить величину энергии взаимодействия в расчете на единичный заряд белка. (Практически это 1 корость повышения энергии взаимодействия в расчете на каждый дополнительный положительный заряд, так как асимметрия в распределении зарядов и отсутствие данных о точных значениях изоэлектрических точек создает трудности при установлении точного числа зарядов белковой молекулы, участвующих во взаимодействии с адсорбентом.) Вывод уравнений, связывающих эти парамет1ры, представлен ниже, а также на рис. 4.7. [c.104] Е (в расчете на заряд г ) — —Zj/D r= 2 кДж-моль 1. [c.105] Отсюда Z2 равно приблизительно —5, т. е. в среднем 5 карбоксиметиль-ных групп оказывают влияние на каждый положительный заряд белка. В основе этих вычислений лежат весьма широкие допущения, но по крайней мере величина, полученная для 22, вполне приемлема, если принять во внимание вероятную пространственную плотность заряженных кластеров карбоксиметильных групп по отношению к размерам белковых молекул. [c.105] где эти данные представлены в виде графика. [c.106] Примечание если источник не указан, то это значит, что фермент выделен из мышц кролика. [c.106] СИХ пор могут конкурировать, по крайней мере в цене, с более новыми и более сложными материалами. [c.108] Теоретически существуют два общих метода элюции белков-(не считая аффинной элюции, разд. 4.4) а) изменение pH буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает для анионообменников используют более низкие значения pH, а для катионообменников — более высокие б) повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод а не всегда дает хорошие результаты. Это объясняется тем, что цри недостаточно высокой буферной емкости резкое и значительное изменение pH по мере элюции белков приводит к плохому разделению индивидуальных компонентов. При-низкой ионной силе буферная емкость должна быть низкой, и попытка изменить значение pH, используя градиент pH, оказывается тщетной из-за буферной силы белков, адсорбированных на колонке, а в случае использования ДЭАЭ-адсорбентов— из-за буферных свойств самого адсорбента. Типичный результат показан на рис. 4.12. Градиент pH может быть успешно использован только тогда, когда интересующие нас белки первыми и очень прочно адсорбируются на ионообменнике. В этом случае можно использовать сильное забуферивание растворов при ионной силе 0,1 и больше. В одной из работ [29] была предложена схема получения сильных буферных градиентов pH при постоянной ионной силе. [c.113] СКОЛЬКО выше их. Разрешающая способность метода очень велика, во многах случаях больше, чем при обычном солевом пра-диенте, о котором речь пойдет дальше. Считается, что каждый компонент может быть полностью элюирован в пределах 0,05 единицы pH, но это, вероятно, оптимум, которого средний белок не достигает. В качестве примеров можно привести белки, хорошо титрующиеся вблизи их изоэлект1рической точки, что является необходимым условием для их изоэлектрического разделения (рис. 4.13). Несомненно, этот метод элюции даже с использованием обычных ионообменников найдет широкое применение в будущем, хотя при крупномасштабном выделении белков следует принимать в расчет соображения о соотношении эффективности метода и его стоимости. [c.115] Следующий этап зависит от результатов предыдущего опыта. Если фермент не адсорбируется ни на одном из использованных ионообменников, это указывает на то, что достигнута высокая степень очистки. 0б разец можно пропустить через колонки с двумя этими адсо рбентами в буфере с промежуточным значением pH, например 7,0. Обе колонки можно соединить вместе или же собрать элюат из первой колонки и довести его pH до нужного значения последний вариант предпочтителен, так как позволяет не менять самого буфера. [c.119] Если фермент адсорбировался на одной из колонок и был успешно элюирован солевым раствором, имеет смысл уточнить pH, при котором он адсорбируется. Для этого следует проверить, будет ли он адсорбироваться, например на КМ-целлюлозе при более йысоком значении pH и на ДЭАЭ-целлюлозе при более низком. В этих условиях может снизиться сорбция других белков. Необходимые для этого буферные растворы описаны ниже. Повышение ионной силы, например добавлением 50 мМ или 0,1 М КС к буферу при том же значении pH, дает тот же эффект. На рис. 4.16 приведена схема таких пробных опытов. [c.120] ЮТСЯ на адсорбенте и могут конкурировать с белками за центры связывания. [c.121] Часто необходимо иметь максимальную буферную емкость при минимальной ионной силе, чтобы обеспечить адсорбцию слабо связывающегося белка. Для того чтобы достичь этого, нужно соблюдать два других правила. Во-п 1рвых, величина рКа буфера не должна отличаться больше чем на 0,5 единицы, л лучше — не больше чем на 0,3 единицы от значения pH используемого буфера. Во-вторых, один из компонентов не должен быть за ряжен, чтобы не повышать ионную силу. При работе с ДЭАЭ-целлюлозой pH 8,0) буфер трис-С1 удовлетворяет всем трем требованиям противоионом служит С1 , рКа триса равно 8,1 (при 25 °С см. разд. 6.1) и буфер состоит из Н-трис+ (не взаимодействует с адсорбентом) и триса (нейтральный). Для КМ-целлюлозы при pH 6,5 подходит буфер К-МЭС противоионом служит К+, величина р/Са МЭС составляет 6,2 и буфер состоит из Н-МЭС (нейтральный) и МЭС (не взаимодействует с адсорбентом). С другой стороны, при использовании фосфата на ДЭАЭ-целлюлозе нарушаются два (по крайней мере) из этих правил, так как здесь имеются противоположно заряженные ионы и ни один из буферных компонентов не нейтрален (НРО и Н2Р04 ). При использовании фосфата на КМ-целлюлозе нарушается только последнее правило. [c.121] Список других возможных буферов приведен в гл. 6 (см. табл. 6.3), другие списки можно найти в литературе (например, [50—52]). [c.121] Образуется комплекс с двухвалентными металлами (особенно гистидин). Летучий. [c.122] Трис(гидроксиметил)аминометан. [c.122] Вернуться к основной статье