ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Ручное чтение из "Секвенирование ДНК" Приведенные здесь далеко не все сложности и особые случаи прочтения нуклеотидной последовательности ДНК с радиоавтографа секвенирующего геля на сегодняшний день полностью потеряли свою актуальность и упомянуты здесь лишь с целью рассказать о трудностях, с которыми сталкивались исследователи при секвенировании ДНК в первые годы. Приме11яемые сегодня ДНК-полимеразы позволяют получать достаточно однородную картину полос ДНК на радиоавтографе и описанные выше проблемы практически не возникают. [c.201] Кроме самих полос ДНК, особое внимание должно уделяться и вертикальным промежуткам между ними. Так, группа сильно приближенных к друг другу полос может свидетельствовать об имеющейся в этом месте компрессии ДНК. Дополнительным аргументом того, что здесь имеется компрессия, может быть увеличенное вертикальное расстояние между полосами, наблюдаемое несколько выше. Подобное происходит вследствие того, что формирующаяся на З -конце новосинтезированной цепи ДНК шпилька увеличивает подвижность таких фрагментов ДНК, а уже для более крупных фрагментов, несущих дополнительные нуклеотиды после шпильки, эта структура становится менее стабильной, вторичная структура исчезает и, как следствие, межполосное расстояние возвращается к прежнему, приводя таким образом к созданию небольшого участка с увеличенным вертикальным расстоянием между соседними полосами. Выявление таких участков с компрессией полос ДНК крайне важно для правильного прочтения этого отрезка нуклеотидной последовательности и в случае невозможности этого -обращение повышенного внимания к этому участку при секвенировании комплементарной цепи ДНК. Увеличенное (двойное) расстояние между полосами может быть также результатом пирофосфорилиза и в этом случае установление типа отсутствующего нуклеотида возможно после секвенирования комплементарной цепи ДНК. [c.203] Наиболее типичный путь переноса нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля в компьютер рассматриваемым здесь ручным методом лежит через предварительную запись этой последовательности на бумагу. Последующее введение данной последовательности нуклеотидов осуществляется с помощью клавиатуры. Таким образом, подобное введение бессмысленных текстов в виде беспорядочного набора букв G, А, Т, С и редко N в компьютер таит в себе еще источник ошибок. Чтобы исключить такие ошибки, в разных компьютерных программах предусмотрено или двойное введение нуклеотидной последовательности, с высокой вероятностью позволяющее выявить несовпадение отдельных нуклеотидов при их повторном занесении, или использовании музыкальных звуков, сигнализирующих о вводе того или иного нуклеотида [Hut hinson, 1986]. Прочитывание компьютером с помощью синтезатора речи занесенной последовательности нуклеотидов позволяет осуществлять ее контроль следя по сделанной записи или радиоавтографу. [c.204] Однако при осуществлении крупных проектов по секвенированию этап чтения нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля становится достаточно узким местом , что вызвало разработку специальных приборов, осуществляющих полуавтоматическое и автоматическое считывание последовательности нуклеотидов и ее занесение в компьютер. Рассмотрению этих систем и будет посвящен следующий раздел данной главы. [c.204] Вернуться к основной статье