ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Введение молекул ДНК в клетки из "Генетическая инженерия" Необходимый этап генно-инженерного эксперимента — введение полученных in vitro гибридных молекул ДНК в пермиссивные клетки (обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов гибридов. [c.32] Введение в клетку нуклеиновой кислоты вируса с последующим образованием вирусного потомства называется трансфекцией. Эффективность трансфекции выражается обычно количеством инфекционных центров (бляшек, негативных колоний), приходящихся на молекулу или на единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полз енные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами. Следует отметить, что нуклеиновые кислоты некоторых типов вирусов не-инфекционны, т. е. неактивны в тесте трансфекции. Это обусловлено тем, что для инициации экспрессии генома данных вирусов необходимы определенные вирусспецифические белки, содержащиеся в вирусных частицах, но отсутствующие в препарате очищенной нуклеиновой кислоты. [c.32] Физиологическое состояние клетки, в котором она способна поглощать нуклеиновую кислоту из окружающей среды, называется компетентностью. Однако многие бактерии, а также дрожжи и культивируемые ю етки животных и растений такой физиологической компетентностью не обладают. Поэтому восприимчивость к экзогенной ДНК у них индуцируют различными способами. Такую компетентность принято называть индуцированной. Наиболее просто она достигается путем определенного химического или физического воздействия на клетки. Разные типы клеток имеют свои особенности строения клеточных стенок и плазматических мембран, поэтому они могут различаться по способам индз ции у них компетентного состояния. [c.32] Исторически первым подходом к пол) ению компетентных для трансфекции (трансформации) клеток бактерий является ферментативный гидролиз клеточных стенок, приводящий к удалению физического барьера на пути проникновения молекул ДНК в клетку. Для этой цели можно использовать различньге индивидуальные ферменты (например лизоцим) или смеси ферментов (например пищеварительный сок виноградной улитки). При ферментативной обработке клетки необходимо помещать в изотонический раствор (0,2 М сахароза 1 М сорбит 0,6 М КС1 и др.), имеющий примерно такое же осмотическое давление, какое характерно для цитоплазмы клетки. В этих условиях клетки, лишенные своего жесткого панциря (клеточной стенки), приобретают шарообразную форму и не лопаются от осмотического шока, наблюдаемого в гипотонической среде. [c.33] В том случае, когда после гидролиза полностью удаляется клеточная стенка и остается только плазматическая мембрана, ограничивающая содержимое клетки, возникает осмотически чувствительный протопласт. Если после ферментативного гидролиза на плазматической мембране остаются фрагменты клеточной стенки или сохраняется внешняя мембрана (что характерно для грамотрицательных бактерий), то такие клетки называют сферопластами. Как и протопласты, они являются осмотически чувствительными и в изотоническом растворе имеют форму шара. [c.33] При получении протопластов и сфероплас-тов большое значение имеет подбор условий, обеспечивающих в последующем эффективную регенерацию клеточных стенок. Процедуры получения протопластов и сферопластов, трансформации их молекулами ДНК, регенерации клеточной стенки и отбора колоний трансформантов многоэтапны, а результат зависит от многих параметров состава растворов, способов обработки и др. Все это приводит к тому, что данные методики отличаются низкой воспроизводимостью, требуют высокой квалификации исполнителя и весьма трудоемки. Поэтому по мере разработки более простых способов данный подход постепенно утратил свое значение. На смену пришли методы обработки клеток растворами солей (см. 2.1). [c.33] Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому для эффективного поглощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется значительно большая напряженность электрического поля (10 кВ/см и более), чем крупным животным и растительным клеткам (1-2 кВ/см). [c.33] Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени он использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов привело к широкому применению данного метода в генетической инженерии самых разных типов клеток. [c.33] Разработка простых, эффективных и воспроизводимых методов введения экзогенных молекул ДНК в нативной форме в пермиссивные клетки является необходимым условием успешного развития работ по клонированию чужеродной генетической информации в клетках любого типа. Поэтому данному направлению исследований уделяется пристальное внимание и оно постоянно развивается. [c.33] Вернуться к основной статье