ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Использование для синтеза генов полимеразной цепной реакции из "Генетическая инженерия" На первой стадии проводили ПЦР полинуклеотидов А, В, С, D в присутствии 7а -полиме-разы. Полученный продукт реакции, не являющийся по данным гель-электрофореза гомогенным, вводили в ПЦР с короткими (длиной 30 нуклеотидных звеньев) олигонуклеотидами Е и F. В результате второй реакции образовался индивидуальный дуплекс, который затем бьш клонирован, но данные о правильности его нуклеотидной структуры отсутствуют. [c.75] Из этих данных следует, что 3 -5 -корректирующие свойства ДНК-полимеразы VentR практически не влияют на соотношение клонов с правильной и неправильной структурой. По-видимому, ошибки в синтезированных генах не связаны с точностью копирования ДНК-по-лимеразами. Судя по всему, эти ошибки уже существовали в синтетических олигонуклеотидах. Полученные результаты хорошо согласуются с данными о том, что величина ошибки при синтезе полинуклеотидов составляет в среднем 0,15 % на нуклеотид. [c.76] С помощью ПЦР целевой ген может быть собран из большого числа олигонуклеотидов, с использованием метода рекомбинации in vitro. На рис. 1.59 приведена схема синтеза фрагмента размером 1,1 тпн, содержащего промотор-ную область и ген /3-лактамазы Ыа). [c.76] Всего было синтезировано 56 олигонуклеотидов длиной 40 звеньев, кодирующих обе цепи целевого дуплекса. Разбиение на олигонуклеотиды осуществлено таким образом, чтобы каждый из НИХ перекрывался с соседними фрагментом длиной в 20 нуклеотидов. Ген Ыа был фланкирован для удобства клонирования сайтами рестриктазы 1. В целом ген синтезирован в 4 стадии синтез олигонуклеотидов, сборка гена, амплификация гена, клонирование искусственного гена в pU 322. 76 % полученных при клонировании колоний имели ожидаемый фенотип Тс Однако единственный секвенирован-ный клон имел в составе целевого гена три мутации. [c.76] Этот же подход применяли для синтеза плазмиды pU 182- , которая отличается от pU 182 только наличием фланкирующих ген Ыа двух 1-сайтов. Дуплекс, соответствующий плазмиде, получали из 134 полинуклеотидов длиной 40 звеньев, а также из двух 47- и 56-нук-леотидных фрагментов. Все полинуклеотиды одновременно использовали в трехстадийной ПЦР, в результате бьш получен высокомолекулярный мультимер (рис. 1.60). [c.77] Гаврилова Е. В., Бабкин И. В., Щелкунов С. Н. Мультиплексный ПЦР-анализ для видоспецифичной экспресс-идентификации ортопоксвирусов // Молекул, генетика, микробиол. и виру-сол. 2003. 1. С. 45-52. [c.77] Георгиев Г. П. Гены высших организмов и их экспрессия. М. Наука, 1989. 254 с. [c.77] Кавсан В. М. Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека проекты и перспективы // Биополимеры и клетка. 1989. Т. 5. С. 16-25. [c.77] Корнберг А. Синтез ДНК. М. Мир, 1977. 359 с. [c.77] Краев А. С., Скрябин К. Г. Методы изучения первичных структур нуклеиновых кислот // Итоги науки и техники. Сер. Молекуляр. биология / ВИНИТИ. М., 1980. Т. 12 Генетическая инженерия (методы). Ч. П. С. 141-197. [c.77] Михеев М. В., Лапа С. А., Щелкунов С. Н. и др. Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах // Вопр. виру-сол. 2003. Т. 48, 1. С. 4-9. [c.77] Репин В. E., Щелкунов С. Н. Распространение и функция рестриктаз // Успехи соврем, биологии. 1990. Т ПО. С. 34-47. [c.77] Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК Краткий курс. М. Мир, 1986. 285 с. [c.77] Вернуться к основной статье