ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Молекулярные векторы на основе ДНК фага лямбда из "Генетическая инженерия" К моменту появления методологии генетической инженерии колифаг Я по сравнению с другими вирусами бактерий был наиболее полно изучен генетически и молекулярно-биологически. Это и обусловило то, что наряду с плазмидными векторами уже в 1974 г. появилась серия клонирующих векторов на основе фага Я. [c.97] В зрелых вирионах фага Я ДНК находится в виде двухцепочечной линейной молекулы размером 48 502 пн. На концах молекулы ДНК имеются взаимокомплементарные G -обога-щенные одноцепочечные концы длиной 12 нуклеотидов (обозначаются как o R и osL). Сразу после попадания в клетку фаговая ДНК цикли-зуется по этим концам и функционирует в клетке в кольцевой форме. Район ковалентно зашитых o R и osh называется os-сайтом. Фаг Я является умеренным фагом, т. е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути. [c.97] Щелкуновой и С. Н. Щелкуновым показано, что среднее ограничение фага Я in vivo системой рестрикции-модификации oRI по каждому из пяти участков воздействия на фаговую ДНК составляет 5,6. У мутантного варианта, имеющего лишь три oRI-участка, при инфицировании рестриктирующего штамма Е. oli будет выживать и давать начало фаговому потомству одна молекула ДНК из 180. Для фага дикого типа (пять oRI-участков) это соотношение будет 1 из 5,5 тыс. молекул. Фаговое потомство, полученное на штамме с R-М-систе-мой, имеет метилированную ДНК. Для того чтобы снять эту модификацию, популяцию фагов с рестриктирующего штамма пассируют на штамме без системы рестрикцрга-модификации и затем снова проводят через рестриктирую-щий штамм. После нескольких таких циклов мутанты фага по местам действия рестриктазы в силу своего селективного преимущества вытесняют из популяции исходный фаг. [c.100] Необходимо отметить, что жизнеспособность вариантов фага Я резко снижается, когда размер их генома составляет более 105 или менее 78 % генома фага дикого типа. Поэтому каждый конкретный векторный фаг имеет ограничения по размеру фрагментов ДНК, которые можно в нем клонировать. Суммарный размер ДНК гибридных фагов должен находиться в интервале 38-51 тпн. [c.100] Существующие в настоящее время векторные фаги Я для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замещения. Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо гена исходного фага, селекция гибридных клонов осуществляется как выявление соответствующих фаговых мутантов. Рассмотрим типичных представителей этой группы векторов. [c.100] Удобны векторы замещения на основе транс-дуцирующих фагов Я (см. рис. 2.17, г-е). При встраивании в эти векторы экзогенной ДНК обычно из фаговой ДНК удаляются фрагменты, в состав которых входят трансдуцируемые этим фагом бактериальные гены. Гибриды выявляются на соответствующих мутантных бактериальных клетках как фаги, утратившие бактериальный ген и поэтому уже не комплементирую-щие мутацию в клетке-хозяине. [c.101] Вернуться к основной статье