ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Векторы Е. oli, детерминирующие секрецию чужеродных белков из "Генетическая инженерия" Разработанные векторные системы на основе нитевидных фагов Е. oli находят широкое применение в генно-инженерных экспериментах (см. 7.5). [c.118] При конструировании гибридов на основе векторных молекул ДНК фага А или фагов серии М1 Зтр удается осуществлять прямой отбор клонов гибридных фагов. В случае же использования плазмидных векторов прямой отбор клеток, содержащих гибридные плазмиды, часто невозможен. Поэтому возникла необходимость в разработке векторных плазмид с системой прямой селекции гибридных вариантов. Предпринятые исследования привели к созданию широкого спектра таких клонирующих векторов некоторые из них мы рассмотрим. [c.118] В 1980 г описана плазмида pTR262 (Ар Тс с1+), в которой экспрессия гена tet pBR322 находится под контролем репрессора фага Я. Эта плазмида детерминирует фенотип Тс , но становится Тс после инактивации фагового гена сГ встройкой в него чужеродных фрагментов ДНК. Поэтому такие гибридные клоны (Ap Тс с1 ) легко отбирать на среде с тетрациклином. [c.121] Как видим, общие подходы к созданию векторных плазмид для прямой селекции их гибридных производных сформулированы и получены разнообразные варианты таких плазмидных векторов, позволяющих существенно облегчить выполнение экспериментов по клонированию фрагментов ДНК. [c.121] Промотор представляет собой последовательность ДНК, которая обусловливает связывание РНК-полимеразы с ДНК и инициацию синтеза РНК. Поэтому промотор является необходимой составной частью вектора, предназначенного для достижения экспрессии клонированных последовательностей ДНК. Кроме того, возможность и эффективность трансляции транскрибируемой мРНК зависит от наличия на ее 5 -конце участка связывания рибосом (RBS, см. 3.3). [c.122] Так как генетический код триплетен и универсален (табл. 2.2), то любая непрерывная кодирующая последовательность может быть экспрессирована в клетках Е. oli в виде полипептида, являющегося цепочкой аминокислотных остатков (табл. 2.3). Однако организация сигналов инициации транскрипции и трансляции в эукариотических и прокариотических генах в подавляющем большинстве случаев существенно различается (см. 4.1). Поэтому для достижения правильной экспрессии эукариотического гена в клетках Е. oli необходимо поместить кодирующую последовательность этого гена под бактериальные сигналы экспрессии генов. [c.122] Экспрессия целевого белка в составе химерного белка. Данный подход может быть реализован благодаря использованию векторных плазмид или фагов, содержащих бактериальные гены или их проксимальные части. Клонируемый ген вводится в эти векторы так, чтобы регуляторная область бактериального гена оставалась неизменной, а встройка происходила в его структурную часть. При совпадении рамки трансляции бактериального гена с рамкой трансляции встроенного гена синтезируется химерный белок, который обладает по крайней мере частью иммунохимических характеристик целевого экзогенного белка. [c.122] В результате встройки в начало гена la Z полилинкера, сдвигающего рамку трансляции, плазмида детерминирует фенотип La Z-Y- Выбор плазмиды pUK270 в качестве вектора экспрессии основан на том, что 25 N-концевых АК /3-галактозидазы можно без нарушения ее ферментативной активности заменить полипептидом любого размера и происхождения. Плазмиду можно использовать для клонирования ДНК с известной последовательностью в любом из расположенных в полилинкере участков действия рестриктаз. Однако в основном данный вектор применяют при клонировании по ЛЛ-участку случайных фрагментов ДНК с использованием достроенных олиго(ёС ёС)-кон-цов (коннекторный метод). [c.125] В качестве хозяина плазмид pQE используют штаммы Е. соИ с мутацией /a lQ, конститутивно продуцирующие /ас-репрессор (см. 2.2.6), что обеспечивает эффективное блокирование транскрипции с сильного промотора фага Т5. Индукция транскрипции достигается добавлением в среду ИПТГ. [c.126] Экспрессия индивидуального целевого белка. При создании продуцентов определенных белков (в том числе человека и животных) наибольший интерес представляют генетические конструкции, обеспечивающие эффективный синтез в клетке-реципиенте чужеродного белка без добавления к нему каких-либо посторонних аминокислотных последовательностей. [c.126] Вернуться к основной статье