ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Влияние эффективности транскрипции клонированных генов на уровень их экспрессии из "Генетическая инженерия" Другие а-факторы (например синтезируемые некоторыми фагами) также существенно изменяют специфичность РНК-полимеразы Е. соИ к промоторным последовательностям. [c.143] Последовательности, 01фужающие относительно высококонсервативные районы -35 и -10, также влияют на силу промотора. Однако закономерности этого влияния пока не определены, и поэтому по последовательности нуклеотидов эффективность промотора оценить невозможно. Каждый промотор индивидуален, и его применимость для решения тех или иных задач может быть оценена лишь экспериментально. [c.143] Терминация транскрипции обычно происходит не на строго определенном нуклеотиде, а на любом из нескольких остатков, расположенных ближе к З -концу U-участка. Оли-го(гЦ)-последовательность из нуклеотидов U на 3 -конце РНК соответствует АТ-богатой области в молекуле ДНК-матрицы. Как видим, АТ-богатые участки ДНК играют важную роль не только в инициации, но и в терминации транскрипции. Каждый терминатор характеризуется определенной эффективностью, которая оценивается как доля цепей РНК, терминация которых на нем произошла. Эффективность терминаторов транскрипции может варьировать в широких пределах, но важно подчеркнуть, что терминаторов, обеспечивающих 100%-ное прекращение синтеза РНК у Е. соИ, не выявлено. [c.145] Стеффен и Р. Шлейф в одной из ранних работ (1977 г.) показали, что трансформация Е. соИ плазмидой рМВ9, несущей ген агаС Е. соН, приводит к 4-кратному увеличению синтеза белка АгаС в клетках. Если же этот ген дополнительно поместить под контроль промотора pia uvs, то продукция белка возрастает уже в 50 раз. [c.145] Иногда для экспрессии чужеродных генов в Е. oli необходимо использовать сильные промоторы, функционирование которых подвергается регуляции. Прежде всего это требуется в тех случаях, когда продукт клонированного гена токсичен для клеток Е. соИ. При этом клетки можно культивировать до определенного момента в условиях, когда транскрипция клонированного гена репрессирована, а затем индуцировать эффективную транскрипцию. Такой подход позволяет вырастить клетки, содержащие гибридные ДНК, до достаточно высокого титра и лишь после этого инициировать продукцию белка, сверхсинтез которого приводит к гибели бактериальных клеток. Кроме того, известно, что интенсивная транскрипция, направляемая сильным промотором, может отрицательно сказываться на эффективности репликации плазмидной ДНК, а это приводит к нестабильности поддержания плазмиды и постепенной ее элиминации из бактериальных клеток. Такие плазмиды могут быть стабилизированы, если дис-тально от сильного промотора встроить эффективные сигналы терминации транс1фипции. [c.146] В одной из первых работ по использованию индуцируемых промоторов в векторную плазмиду — производную pBR322, содержащую в своем составе сильный промотор рь фага Я, встроили ген trp А. Гибридную плазмиду ввели в лизогенные клетки Е. oli, в которых синтезируется термочувствительный репрессор фага Я. При температуре 30 °С продукция триптофан-синтетазы А практически не увеличилась. Однако после термической инактивации репрессора начинает функционировать промотор рь, который при температуре 37 °С направляет сверхсинтез триптофансинтетазы, и выявляемый уровень активности этого фермента возрастает в 30-50 раз. [c.146] Необходимо отметить, что рассмотренные варианты индуцируемой транскрипции имеют определенные недостатки. Так, при повышении температуры среды индуцируется экспрессия не только целевого гена, но и ряда генов клетки-хозяина, в том числе и генов протеаз. Использование химических индукторов, как правило, ограничивается лишь лабораторным масштабом, так как удорожает биотехнологический процесс. [c.147] Существует подход, лишенный этих недостатков. Известно, что многие фаги Е. соИ кодируют РНК-полимеразы, способные взаимодействовать лишь со специфическими промоторами поздних фаговых генов. Наиболее хорошо изучена РНК-полимераза фага Т7. В противоположность многосубъединичным РНК-полиме-разам бактерий и эукариот, она является мономерным белком (как и аналогичные ферменты других фагов) с молекулярной массой 99 кДа. В отличие от фермента клетки-хозяина РНК-полимераза Т7 узнает строго специфическую непрерывную последовательность размером 23 пн, прилегающую к точке инициации транскрипции. Скорость элонгации РНК-полимера-зой Т7 в 5 раз выше, чем ферментом Е. oli. [c.147] Чтобы Преодолеть указанные затруднения, предложен ряд модификаций системы экспрессии, зависимой от фага Т7. Целевой ген вводится в клетки Е. oli в составе плазмиды под контролем промотора фага Т7. Данный промотор РЖ-полимеразой клетки-хозяина не узнается, и изучаемый ген находится в строго репрессированном состоянии. После того как культура с гибридной плазмидой достигнет определенной плотности, ее можно заразить фагом Т7 или гибридными фагами Я либо М13, несущими ген РНК-полимеразы Т7. В первых двух случаях клетки спустя некоторое время будут лизиро-ваться. В последнем — лизиса клеток не наблюдается. При инфекции фагом Я лизиса клеток также можно избежать, если ввести в вектор мзтации по генам QkS (см. 2.2.2). Кроме того, в качестве клетки-хозяина можно использовать Е. oli, лизогенную по гибридному фагу Я, несущему ген РНК-полимеразы Т7, и в нужный момент индуцировать его из состояния профага. [c.148] В ряде лабораторий были созданы векторные плазмиды экспрессии, у которых сильные промоторы тандемно повторены (для примера см. на рис. 3.4 плазмиду рКВ252). Показано, что дупликация промоторов приводит к усилению транскрипции клонированных генов. Такой же эффект наблюдается и при комбинации дв)ос различных промоторов. Поэтому данный подход к увеличению продукции целевого белка используют довольно часто. [c.148] В настоящее время существует широкий набор генетических конструкций, обеспечивающих высокоэффективную транскрипцию клонируемых генов. [c.148] Вернуться к основной статье