ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Стабилизация чужеродных мРНК и белков в клетках из "Генетическая инженерия" Для получения в клетках Е. соН высокого уровня белкового продукта клонируемого чужеродного гена порой недостаточно увеличить дозу гена за счет копийности векторной молекулы или повысить эффективность считывания генетической информации, поместив кодирующую последовательность под эффективные сигналы транскрипции и трансляции. Такие случаи возникают, если синтезируемые в бактериальной клетке чужеродные мРНК или белки подвергаются быстрой деградации клеточными ферментами. [c.152] Мутанты Е. ali Ion имеют сниженную способность к деградации чужеродных и дефектных белков. Это обусловливает значительное увеличение в таких мутантах времени полужизни чужеродных белков и в итоге приводит к их суперпродукции. Таким образом, введение мутации по гену Ion реципиентных клеток Е. oli является перспективным подходом к существенному повышению эффективности штаммов — продуцентов чужеродных белков. Введение дополнительных мутаций по некоторым генам, кодирующим другие протеазы или регулирующим выражение генов протеаз, может привести к еще большей стабилизации чужеродного белка в клетках Е. oli. Несомненный интерес для генетической инженерии представляют такие штаммы Е. соИ, в которых объединены различные мутантные локусы, повышающие стабильность молекул как мРНК, так и белков. [c.153] Значительное влияние на активность протеаз клетки оказывают условия культивирования бактерий, и прежде всего состав питательных сред. В частности, для многих бактериальных систем известно, что протеолиз увеличивается при дефиците аминокислот, фосфатов, сульфатов. Недостаток аммония, а также культивирование при повышенной температуре приводит к сверхпродукции протеаз. Например, при прочих равных условиях интерферон а2 человека в клетках Е. oli при температуре 25 °С синтезируется с выходом, большим в 40 раз, чем при температуре 37 °С. [c.153] Известно, что катионы цинка ингибируют действие протеаз Е. соН. Поэтому, вводя в питательную среду определенное количество Zn2+, можно добиться значительного увеличения уровня чужеродного белка, синтезируемого в клетках Е. соИ. [c.153] Генотип клетки — реципиента гибридной ДНК также может существенно влиять на эффективность извлечения из нее синтезированного чужеродного белка в неповрежденном виде. В частности, использование штамма Е. соИ, дефектного по гену отрТ, детерминирующему мембранную эндопротеазу, значительно облегчает процедуру выделения нативного чужеродного белка из бактериальных клеток. [c.154] Тэлмэйдж и В. Гилберт в 1982 г предложили новый подход к стабилизации чужеродных белков в клетках Е. соИ путем создания гибридного гена, белковый продукт которого способен секретироваться в периплазму Е. oli (см. 2.2.10), где он защищен от действия многочисленных протеаз цитоплазмы клетки. На примере ряда эукариотических белков показано, что таким образом удается существенно повысить выход целевого белка. [c.154] Дальнейшие исследования показали, что в клетках Е. соИ при высоком уровне продукции как прокариотических, так и эукариотических белшв, превышающем 20 % суммарного клеточного белка, во многих случаях в цитоплазме образуются тельца включения — нерастворимые агрегаты (гранулы), хорошо видимые под фазово-контрастным микросшпом. Обнаружено, что гранулы, формируемые при сверхсинтезе белка, содержат и небольшое количество примесей, в состав которых входят различные белки клетки, рибосомные РНК и даже плазмидная ДНК. Эти примеси, по-видимому, со-осаждаются с белком, образующим тельца включения. В настоящее время разработаны достаточно простые методы выделения телец включения и перевода их в растворимое состояние. [c.154] В совокупности рассмотренные данные демонстрируют, что для достижения высокого уровня продукции чужеродного белка в бактериальной клетке кроме структуры гибридной молекулы ДНК большое значение имеет генотип клетки-реципиента, а также условия культивирования создаваемых штаммов. В сочетании все эти факторы могут обеспечивать в клетках Е. ali удивительно высокий вькод целевых белков, превышающий 50 % суммарного белка бактерии. [c.154] Щелкунов С. Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. Новосибирск Наука, 1987. 168 с. [c.154] Вернуться к основной статье