ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Конструирование штаммов — продуцентов первичных метаболитов на основе из "Генетическая инженерия" Вопрос о возможности экспрессии эукариотических генов в бактериальной клетке представляет большой научный интерес, чем объясняется значительное число посвященных ему исследований. [c.158] Все рассмотренные варианты экспрессии клонированных генов реализованы в многочисленных экспериментальных работах. Тестирование продуктов экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках при этом осуществляют несколькими взаимодополняющими методами, в частности, путем оценки их ферментативной активности, иммунохимических и физико-химических свойств. [c.158] Дальнейшие исследования позволили выявить экспрессию в клетках Е. соИ целого ряда других генов дрожжей-сахаромицетов. Во всех случаях показано, что клетки Е. oli, излеченные от гибридных молекул ДНК, снова становятся ауксотрофными. Используя методику вюмплементации мутаций Е. соН, удалось выявить автономную экспрессию в бактериальной клетке клонированных генов других низших эукариот (табл. 4.1). [c.159] Примечание. В том случае, когда ген донора указан, клонирован фрагмент ДНК, который в Е. oli не экспрессирует фермент, комплементирующий указанную мутацию Е. соИ, однако ген донора не идентифицирован или не имеет принятого обозначения. [c.159] которые содержали хромосомные последовательности генов интерферона. В результате анализа 240 тыс. клонов выделили 10 клонов, 8 из которых синтезировали в Е. соН (хотя и с низкой эффективностью) лейкоцитарный интерферон — от 3 тыс. до 50 тыс. единиц активности на 1 л бактериальной культуры. Для одного клона была расшифрована нуклеотидная последовательность вставки и показано отсутствие в гене интерферона интронов. [c.160] Известно, что в системе эукариотических клеток трансляция инициируется с кодона AUG (в позиции 189). Необходимо отметить, что реинициация трансляции в эукариотической последовательности возможна еще и потому, что в районах, предшествующих инициаторным триплетам в позициях 144 и 189, имеются участки с определенной степенью комплементарности З -концу 16S рРНК, т. е. формируется бактериальный участок связывания рибосом (см. рис. 4.3). [c.160] Как видим, некоторые эукариотические гены с непрерывной кодирующей последовательностью могут быть экспрессированы в бактериальных клетках. Достаточно высокого уровня экспрессии таких генов можно достигнуть, встраивая их под сильные бактериальные промоторы и формируя эффективно функционирующие в Е. oli участки связывания рибосом. [c.160] В ряде работ кДНК соединяли в составе экспрессирующих векторов с фрагментом гена la Z, содержащим промотор, участок связывания рибосом и триплеты нескольких первых аминокислот /3-галактозидазы Е. oli, которые задавали рамку трансляции клонированной кодирующей последовательности. При совпадении рамок трансляции /3-галактозидазы и клонированной кДНК в бактериальных клетках синтезировался целевой эукариотический белок, но содержащий на N-конце дополнительно несколько аминокислот /3-галактозидазы. При этом иммунохимические свойства эукариотического белка могли сохраняться. [c.161] Подобную систему предложили К. Нагаи и X. Тоджерсен (1984 г.), но вместо коллагеназо-специфичной последовательности они использовали тетрапептид Ile-Glu-Gly-Arg, специфично узнаваемый фактором коагуляции крови Ха. Фактор Ха узнает эту последовательность в составе тройного химерного белка и расщепляет его только по остатку аргинина. В результате можно достаточно просто и с высокой эффективностью получать индивидуальный эукариотический белок, соответствующий по всем свойствам природному прототипу (в частности, он не имеет N-концевого метионина). Данный тетрапептид редко встречается в последовательностях белков, и поэтому разработанная система экспрессии-выщепления может быть использована для эффективной продукции в клетках Е. oli многих эукариотических белков. [c.162] Вернуться к основной статье