ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Конструирование гибридных аденовирусов из "Генетическая инженерия" Следует отметить, что экспрессирующие векторы на основе ВРУ-1, несущие доминантные селективные маркеры, можно ввести в самые разные культуры клеток млекопитающих и отобрать трансформанты по проявлению этих биохимических маркеров. В клетках, не поддерживающих эписомное состояние генома ВРУ-1, гибридные молекулы ДНК интегрируются в хромосомы. [c.371] Важное свойство векторов на основе ВРУ-1 состоит в том, что они практически являются плазмидами морфологически трансформируемых ими эукариотических клеток и в их составе можно клонировать крупные фрагменты ДНК. В целом использование вируса папилломы быка в качестве молекулярного вектора, несомненно, полезно и дополняет систему клонирования и изучения функционирования генов в различных клетках млекопитающих. [c.371] Лучше всего юучены аденовирусы человека типов 2 и 5 (Ad2 и Ad5). Эти вирусы очень похожи и имеют гомологию по последовательности ДНК около 99 %, что обусловливает их эффективную рекомбинацию между собой. Аденовирусы характеризуются узким кругом хозяев. Они интенсивно размножаются только в организме или культуре клеток естественного хозяина. В чужеродной системе аденовирусы иногда могут реплицироваться, но очень слабо. Ad2 и Ad5 удается легко наработать в больших количествах в суспензионной культуре клеток человека HeLa. [c.371] Продукты гена Ela стимулируют активность пяти промоторов на раннем этапе цикла развития аденовируса. В свою очередь белок Elb актрширует транскрипцию с промотора гена Ela. Показано, что для эффективного развития вируса необходимы продукты обоих генов — Ela и Elb. [c.373] Для развития в культуре клеток ген ЕЗ не обязателен. Это доказано с помощью различных мутантов по области 79-86 ед. карты генома Ad2 и Ad5. [c.373] Ген Е4, как Е1 и Е2, жизненно важен и кодирует ряд полгаептидов, функция которых пока до конца не выяснена. [c.373] На поздней стадии цикла развития аденовирусы блокируют синтез белков клетки и направляют синтез огромного количества белковых продуктов своих поздних генов, большая часть которых являются структурными белками вирионов. Сборка вирионов происходит в ядре клетки. Продуктивная инфекция аденовирусами заканчивается лизисом клеток. [c.373] ДНК осуществляется по механизму вытеснения цепи (рис. 14.17). После завершения процесса репликации молекулы белка рТР остаются ковалентно связанными с концами ДНК, но подвергаются протеолитическому процессингу, в результате чего их масса с 80 кДа уменьшается до 55 кДа, и эта форма обозначается ТР. [c.375] Относительно небольшой размер, хорошая изученность организации и фунвсционирования генома аденовирусов, наличие ограниченного числа участков гидролиза различными рестриктазами на вирусной ДНК и высокая гомология ДНК Ad2 и Ad5 позволили успешно осуществить первую серию экспериментов по встройке in vitro в геном аденовирусов чужеродных фрагментов ДНК и отбору гибридных вирусов. Эти работы заложили основу генно-инженерной методологии создания аденовирусов, экспрессирующих чужеродные гены. [c.375] Относительно высокий уровень трансфекции полностью депротеинизированной ДНК Ad2 и Ad5 достигается в клетках линии 293, которую получили Ф. Грэхем с соавторами (1977 г.) в результате трансформации клеток почки эмбриона человека фрагментом ДНК Ad5. В клетках 293 происходит конститутивный синтез полипептидов, кодируемых генами Ela и Elb аденовируса. Наличие в клетках определенной концентрации этих вирусных белков обусловливает повышенный уровень инфекционности ДНК аденовирусов. Трансфекцию молекулами ДНК аденовирусов человека обычно проводят именно на данной линии культивируемых клеток или ее производных. [c.375] Таким образом, клонированные концевые фрагменты аденовирусной ДНК сохраняют свою биологическую активность. Это позволяет существенно упростить процедуру конструирования гибридных аденовирусов, содержащих чужеродные гены. [c.377] Как отмечалось выше, в первых экспериментах методами генетической инженерии конструировали дефектные гибридные аденовирусные геномы, для функционирования которых был необходим вирус-помощник. Исследователи вынуждены были работать со смешанной популяцией вирусов, причем содержание гибридного вируса в такой популяции было не более 10 %. В связи с этим несомненный интерес представляет разработка векторной системы аденовирусов, не требующей использования вируса-помощника. [c.377] Вернуться к основной статье