ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ из "Методы изучения митохондрий растений Полярография и электрофорез" или протеины (в переводе с феческого означает первые или важнейшие - один из основных классов биологических макромолекул. Белки - это наиболее многочисленные и исключительно разнообразные по своим функциям макромолекулы. [c.37] Все белки во всех организмах, независимо от их функции и биологической активности, построены из одного и того же основного набора 20 аминокислот, каждая из которых, взятая в отдельности, не обладает свойственной нативным белкам биологической активностью. Аминокислоты - это алфавит белковой структуры соединив их в различном порядке, можно получить почти бесконечное число последовательностей и, значит, почти бесконечное множество разнообразных белков. [c.37] Хотя четкого разграничения не существует, короткие цепи принято назьюать пептидами или олигопептидами (олиго- значит несколько), а под полипептидами понимают обычно цепь из 80-ти и более аминокислот. [c.38] Уровни структурной организации белка от первичной структуры - к четвертичной. [c.39] Последовательность аминокислот, ковалентно связанных в нолинептидную цепь, называется первичной структурой белка. Полипептидная цепь принимает специфическую конформацию, известную как вторичная структура белка, которая в свою очередь укладывается в компактное образование, именуемое третичной структурой. Такое образование, сформированное первичной, вторичной и третичной структурами, может представлять собой либо самостоятельный белок, либо в качестве мономера (субъединицы) ассоциироваться с такими же или другими мономерами, образуя сложный мультимерный белок. Под четвертичной структурой понимают расположение в пространстве взаимодействующих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепями белка (Рис. 11). [c.39] Вторичной структурой называют иространственное расположение атомов главной цепп белка на отдельных ее участках. Согласно более раннему определению, вторичная структура - это те сегменты полипептидной цепи, которые участвуют в формировании регулярной сетки водородных связей. В соответствии с этими определениями любой участок белка имеет вторичную структуру. Иногда рассматривают как вторичную структуру только те ее элементы, которые являются периодическими а-спираль и (3-структуру. Однако в белках нередко встречаются такие участки пептидной цепи, которые уложены вполне определенным способом, хотя их пространственная структура не содержит какого-либо периодически повторяющегося, регулярного мотива. Тем не менее к ним вполне приложимо понятие вторичной структуры. Следует различать два вида вторичных структур регулярные и нерегулярные. [c.39] Пептидная цепь содержит множество С=0- и N-H- групп пептидных связей, каждая из которых потенциально способна участвовать в образовании водородных связей. До тех пор пока это потенциальное связывание не произойдет структура будет настойчива. Партнерами для связывания этих групп являются другие такие же группы из той же или соседней полипептидной цепи. При этом образуются два главных типа структур а-спираль, в которую цепь сворачивается как шнур от телефонной трубки, и р-структура, в которой бок о бок уложены вытянутые участки одной или нескольких цепей. Обе эти структуры весьма стабильны они встречаются на периферии белковых гло л (где расположены гидрофильные боковые группы аминокислот) и в их внутренней области (где расположены гидрофобные боковые группы). [c.40] Принцип организации прост. Полипептидная цепь находится в растянутом состоянии, а ее С=0- и N-П-группы связаны водородными связями с такими же группами соседней, параллельно ориентированной полипептидной цепи. Полипептидные цепи могут быть направлены в одном и том же или в противоположном направлениях в первом случае складчатый слой называют параллельным, а во втором - антипараллельным. [c.41] Дальнейшая укладка вторичных структур в компактную структуру глобулярного белка носит название третичной структуры (Рис. 11с). [c.41] поддерживающие третичную структуру 1) ковалентная дисульфидная связь (самая прочная) 2) ионная (электростатическое взаимодействие) 3) водородная связь (слабое электростатическое взаимодействие) 4) гидрофобные взаимодействия (Рис. 12). [c.42] Третичная структура завершает описание строение молекулы белка. Есть много белков, молекулы которых представляют собой комплексы, образованных из нескольких белковых молекул, соединенных нековалентными связями. Назьшают их олигомерными, мультимерными или субъединичными белками. Субъединица - отдельная полипептидная цепь, имеюш ая свою собственную третичную структуру. Укладку субъединиц в фукционально активном белковом комплексе называют четвертичной структурой белка (Рис. lid). [c.43] Белок с исходной, природной укладкой цепи называют нативным, а белок с развернутой, беспорядочной уютадкой цепи -денатурированным. [c.43] Укладка цепи в нативные белки осуш ествляется в значительной мере благодаря слабым нековалентным связям, поскольку ковалентные связи при умеренном нафевании не разрываются. Сама полипептидная цепь в этих условиях остается интактной. [c.43] Денатурация белка - денатурацией назьшают суш ественные изменения вторичной и третичной структуры белка (Рис. 13), т.е. нарушение, разупорядочение нековалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентную структуру. Денатурация, как правило, сопровождается инактивацией белка. Однако инактивация сама по себе не может служить критерием денатурации (конформационные переходы в белке не приводят к утрате упорядоченности в структуре белка). Характерным признаком денатурации является именно утрата упорядоченности. Переход от нативного состояния к денатурированному происходит резко и скачкообразно. [c.43] Воздействие на белок реагентов, нарутаюгцих нековалентные взатюдействия, прежде всего систему водородных связей. Для стабильности структуры белка необходимо образование не менее 90% возможных водородных связей внутри бежовой глобулы. Разрыв значительной их части вызовет переход нативной структуры в денатурированное состояние. К таким реагентам относятся концентрированные растворы мочевины (6-8 М), солянокислого гуанидина (б М), органические растворители (спирты, формамид, муравьиная кислота) и ионные детергенты (анионный детергент - додецилсульфат натрия). [c.44] Молекула мочевины как бы имитирует пептидную связь и способна выступать и как донор и как акцептор водородных связей, конкурируя с пептидными и функциональными группами белка, образующими в нативной структуре внутримолекулярные водородные связи. Денатурация белка при увеличении содержания мочевины в растворе происходит скачкообразно. Действие высоких концентраций мочевины, кроме того, может быть связано и с нарушением структуры воды (за счет образования водородных связей с молекулами мочевины). [c.44] Установить полноту денатурации, т.е. полное исчезновение системы нековалентных взаимодействий, свойственных нативной структуре, довольно трудно. Обычно ограничиваются тем, что наблюдают за изменением какого-либо одного физического параметра структуры белка. Полагают, что денатурация завершилась, если наблюдаемый параметр достигает предельного значения. Папример, если спектр флуоресценции перестает изменяться, достигнув формы, характерной для белка, в котором все остатки триптофана и тирозина равно доступны растворителю. [c.45] К наиболее широко применяемым методам определения концентрации белка относятся следуюш ие биуретовая реакция, метод Лоури, метод Гринберга, метод Бредфорда, измерение поглош ения в ультрафиолетовой области спектра. [c.45] Мешающие соединения пептиды, ТРИС, сахароза и желчные пигменты дают окраску в биуретовой реакции соли аммония, ТРИС, сахароза и глицерин оказьшают влияние на окраску, даваемую белками липиды и детергенты могут вызвать помутнение. [c.46] Вернуться к основной статье