ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ (ПААГ С ДДС-NA) (ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ) из "Методы изучения митохондрий растений Полярография и электрофорез" Оборудование, материалы, реактивы. Работу по выделению и очистке белков проводят в холодной комнате или специальном криостате при температуре О - 4°С (Рис. 4). Из оборудования основными являются центрифуги с охлаждением до О С и ниже, применяемые для отделения осадков гомогенизаторы для разрушения клеток, спектрофотометр, служаш ий для измерения концентрации белков и активности ферментов, а также обычное лабораторное оборудование весы, рН-метры, мешалки, градуированные цилиндры, пипетки и микропипетки, аппараты для приготовления льда или жидкий азот. Из реактивов необходимы различные буферные растворы, сульфат аммония, реактив Фолина-Чокальтеу, органические растворители и т.д. Жидкие химические реактивы должны быть перегнаны, сухие - перекристаллизованы. В работе желательно применять бидистиллированную воду. [c.50] Исходный материал. В основном белок вьщеляют из этиолированных побегов проростков растений. Чем быстрее используется сырье, тем лучше, поскольку препарат получается более соответствуюш ий физиологическому состоянию. В случае необходимости хранения, как сырье, так и экстракты из него необходимо хранить в замороженном виде в кельвинаторе или жидком азоте. Чем выше скорости замораживания и оттаивания, тем лучше. [c.50] Разрушение клеток и экстракция. Растительные клетки разрушаются труднее, чем клетки животных, из-за наличия у них целлюлозной оболочки. При их разрушении применяют следуюш ие методы механическое разрушение крупных клеток и отделение друг от друга мелких с помош ью лопастного гомогенизатора растирание в ступке с абразивом (происходит разрушение клеточных стенок за счет шероховатостей на ступке и пестике) использование пресса Френча (клетки продавливаются через маленькие отверстия под давлением). [c.50] Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в 0,0625 М трис-НС1, pH 6,8. Рабочий гель полимеризуют в 0,0375 М трис-НС1, pH 8,8. Полимеризацию инициируют, добавляя к раствору свежеприготовленный персульфат аммония, вместе с веществом, захватывающим свободные радикалы для этого обычно используют TEMED (К,К,К ,К -тетраметилэтилендиамин). [c.54] Персульфат аммония в водном растворе разлагается, поэтому его используют только свежеприготовленным. При приготовлении гелей он добавляется в последнюю очередь, поскольку является инициатором процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата приводит к образованию достаточно долго живущих свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода. Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова образуется радикал с не спаренным электроном, но у атома С. [c.54] Этот радикал вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы акриламида с образованием нового радикала и т.д. Цепная реакция полимеризация идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой не образуют обычную ковалентную связь. [c.55] ТЕМЭД - захватывая свободные радикалы, служит катализатором реакции полимеризации и ускоряет его протекание. [c.55] Первые полчаса, когда образцы входят в гель, устанавливают силу тока 50 мА на блок. Далее электрофорез проводят при постоянной силе тока 80 мА три часа, пока свидетель (бромфеноловый синий) не доходит до конца гелевого блока. После окончания электрофореза стеклянные пластины вынимают из прибора и освободившийся гель помеш ают в камеру для окрашивания или используют для переноса на нитроцеллюлозную мембрану. [c.56] Определение молекулярных масс полипептидов. [c.57] Определение молекулярных масс полипептидов проводят, используя в качестве стандартов набор белков ( Pharma ia , Швеция). После окрашивания гели сканируют, и молекулярные массы исследуемых полипептидов определяют по калибровочной кривой, которую строят для каждого геля по методике, прилагаемой к набору, при помощи программы Sigmagel . [c.57] Вернуться к основной статье