ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Список со к ращений из "Практикум по биохимии Изд.2" Приступая к работе, необходимо из набора, который прилагается к каждому ФЭКу, выбрать кюветы оптимального размера. Так как согласно уравнению Л=е С1, оптическая плотность зависит от толщины поглощающего слоя, выбор кювет должен быть сделан с таким расче- том, чтобы значения оптических плотностей для проб стандартного ряда укладывались в интервале 0,1—1,0. Для получения точных результатов лучше работать в более узком интервале от 0,1 до 0,6 единиц оптической плотности. Выбор кювет проводят следующим образом определяют оптическую плотность одной пробы стандартного ряда со средним содержанием анализируемого вещества, пользуясь кюветами с расстоянием между рабочими гранями, равным 1 см. Если значение оптической плотности составляет приблизительно 0,3—0,35, то данную кювету используют для работы, если больше или меньше этого интервала, берут кювету меньшего или большего размера. Остальные требования к кюветам такие же, как при спектрофотометрическом анализе. [c.9] Результаты колориметрированин проб стандартного ряда оформляют в виде графика зависимости интенсивности окраски от количества анализируемого вещества. По оси ординат откладывают значения оптической плотности по показанию ФЭКа, а по оси абсцисс — содержание вещества в соответствующей пробе. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат. Экстраполировать полученную прямую к значениям оптических плотностей, лежащим выше последней экспериментально полученной точки, не следует. Обычно для получения калибровочного графика достаточно пяти проб стандартного ряда, чтобы получить пять равномерно расположенных точек в интервале чувствительности конкретного метода. При воспроизведении графика можно воспользоваться несколькими пробами с количествами вещества, близкими к среднему. [c.9] Следует заметить, что калибровочные графики, построенные с реактивами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реактивов график необходимо построить заново. График, полученный при работе на одном ФЭКе, недопустимо использовать для расчета результатов колориметрирования, проведенного на другом приборе. Особенности приборов, главным образом различия в моно-хроматизации света, влияют на чувствительность фотометрических определений. При монохроматическом излучении тангенс угла наклона зависимости A=f( ) имеет большую величину, чем тогда, когда поток света состоит из нескольких излучений различных длин волн, из которых только часть поглощается исследуемым раствором. [c.9] После измерения оптической плотности в опытных пробах проводят расчеты, пользуясь калибровочным графиком. Если оптическая плотность пробы выходит за его пределы, необходимо заново приготовить раствор с таким количеством вещества, чтобы попасть на калибровочную прямую. Разбавлять реакционную смесь перед колориметри-рованием не следует это может привести к неверным результатам. По графику определяют содержание анализируемого вещества и, учиты-. вая объем исследуемого раствора, рассчитывают его количество в 1мл сначала для каждой пробы, а затем находят среднее значение. [c.9] Манометрический метод, разработанный О. Варбургом в 20-х годах для определения дыхания переживающих тканей, может быть использован и для исследования других обменных процессов, например гликолиза, дезаминирования, изучения ферментов и субстратов промежуточного обмена веществ. Метод позволяет определять изменение давления в замкнутой системе за счет выделения или поглощения в процессе реакции газообразного продукта. Этим замкнутым пространством служат сосудики разнообразной формы, присоединенные посредством шлифа к манометру, заполненному специальной, не смачивающей стенки манометра жидкостью. Зная объем замкнутого пространства V и измерив наступившее в результате реакции изменение давления к, можно рассчитать объем образовавшегося или поглощенного газообразного продукта. Измерения производят в аппарате Варбурга. [c.10] Аппарат состоит из специального манометрического устройства — сосудиков, соединенных с манометрами (рис. 1), и водяного термостата с чувствительной терморегуляцией (до 0,05°С), в который погружены сосудики. На внешней стороне термостата имеются специальные крепления для манометров. Термостат снабжен механическим устройством, обеспечивающим равномерное покачивание погруженных в термостат сосудиков. Это обеспечивает равновесие между газовой фазой и инкубируемым раствором. [c.10] Рекомендуется между шлифом на конце бокового отростка и сосудиком иметь вставку, представляющую собой короткую (5—7 см) трубку, верхняя часть которой притерта в виде длинного конуса к шлифу манометра, а нижняя — к шлифу сосудика. Притертая поверхность в виде длинного конуса позволяет иметь к одному и тому же манометру несколько (две-три) хорошо притертых вставок, нижняя часть которых, в свою очередь, притерта к различным сосудикам. [c.11] Вставка и притертый к ней сосудик хранятся вместе. В любой момент они могут быть использованы для работы с тем манометром, к которому пришлифована вставка. [c.11] Определение константы сосудиков. До начала измерений следует установить величину констант сосудиков К. Физический смысл константы можно характеризовать объемом газа (приведенного к нормальным условиям), который должен выделиться или поглотиться в системе, чтобы вызвать смещение жидкости в манометре на 1 мм. Величина константы зависит от объема сосудика и прилегающей к нему части манометра, объема помещаемой в сосудик реакционной смеси, от природы выделяющегося или поглощаемого газа (СО2, О2 и др.) и температуры термостата во время опыта. Чтобы определить количество газа, образовавшегося или поглощенного во время опыта в данный отрезок времени, и выразить это количество в кубических миллиметрах, величину К умножают на разность между начальным и конечным давлением в системе, выраженной в миллиметрах столба манометрической жидкости. Из сказанного следует, что размерность константы выражается в квадратных единицах, например в мм . [c.12] Точность полученных на аппарате Варбурга результатов зависит от того, насколько тщательно определена величина константы. Имея это в виду, следует несколько раз повторить определение константы каждого сосудика и лишь при хорошем совпадении результатов взять среднюю величину. Как уже было сказано, величина константы определяется объемом газового пространства, в котором протекает реакция. Этот объем зависит от объема сосудика с прилегающими частями манометра до уровня манометрической жидкости (назовем его V) и от объема используемой в опыте реакционной смеси (У)). Объем газового пространства во время опыта будет равен Так как объем опытной жидкости и используемых реактивов, помещаемых в сосудик, экспериментатору известен, то для выяснения величины 1 —прежде всего необходимо определить объем сосудика с прилегающей к нему частью манометра вплоть до уровня манометрической жидкости, т. е. V. Каждое колено и-образной манометрической трубки имеет 300 делений. В правом колене, сообщающемся с помощью изогнутой под прямым углом отводной трубки ( коленчатого отростка ) с сосудиком, удобно при всех отсчетах устанавливать жидкость на делении 150. В таком случае под объемом сосудика, с прилегающей частью манометра, т. е. под объемом V, понимается сумма объемов сосудика а, вставки б, коленчатой капиллярной трубочки в, соединяющей сосудик с манометром, и манометрической трубки г, идущей от крана д до манометрической жидкости, заполняющей капиллярную трубку манометра и установленной на делении 150. [c.12] Монтаж манометров и заполнение их манометрической жидкостью. Чистый и сухой манометр укрепляют на подставке — специальной доске, на поверхности которой, обращенной к манометру, имеется зеркало, а наверху — металлическая пластинка, дающая опору коленчатому отростку манометра. Между металлическими перемычками, фиксирующими манометр на подставке, и стеклом манометра должны быть проложены резиновые прокладки. [c.12] Один конец хорошо прокипяченной и высушенной эластичной резиновой трубки длиной 10—15 см и подходящего к манометру диаметра закрывают оплавленной стеклянной палочкой и осторожно через открытый конец заполняют доверху манометрической жидкостью. Необходимо следить за тем, чтобы в трубке не оставалось пузырьков воздуха. Трубку с жидкостью надевают на нижний отросток манометра е. Значительная часть ее должна находиться под винтовым зажимом, давящая поверхность которого отстоит примерно на 0,5 см как от нижнего отростка манометра, так и от стеклянной палочки, запирающей резиновую трубку снизу. [c.13] Медленными движениями винтового зажима поднимают жидкость в обоих коленах манометра и очень медленно ее опускают. Уровень жидкости должен подниматься до деления 300 и опускаться до нуля. Если жидкость не поднимается до верхнего деления или останавливается выше нулевого деления, это значит, что ее либо слишком мало, либо слишком много. В таких случаях количество жидкости надо соответственно увеличить или уменьшить. Это делается следующим )бразом закрывают пробкой отверстие шлифа ж на коленчатом отростке манометра (см. рис. 1) и при открытом кране опускают жидкость почти до нуля. Затем закрывают кран д манометра и, осторожно сдавливая резиновую трубку винтовым зажимом, поднимают жидкость в левом колене манометра до тех пор, пока она не появится в воронкообразном его расширении з. После этого жидкость или добавляют, или отбирают ее излишки через воронку з (см. рис. 1). Открыв кран манометра, снова проверяют правильность заполнения прибора. [c.13] Если в манометрическую жидкость попадают пузырьки воздуха, их удаляют переводят жидкость вместе с пузырьками воздуха в левое колено манометра (см. выше) и собирающуюся сверху пену осторожно отсасывают свернутой в трубочку фильтровальной бумагой. Так поступают несколько раз до полного удаления пузырьков воздуха. После этого медленными поворотами винтового зажима опускают манометрическую жидкость, открывают кран и снова поднимают ее в обоих коленах манометра до деления 150. [c.13] Одним из наиболее надежных методов определения газового пространства является манометрический метод. Принцип этого метода заключается в том, что определяют добавочные давления /11 и /12 при введении некоторого одинакового количества газа в систему в одном случае при пустом сосудике кх), в другом — при частичном заполне-иии сосудика определенным количеством воды (/12). Если объем сосудика больше 20 см то кч удобно определять при почти нацело заполненном сосудпке, а А.1 — при заполненном приблизительно наполовину. В этом случае следует тщательно определить объем отобранной и оставшейся в сосудике воды. Все определения должны быть проведены при постоянной, например комнатной, температуре термостата. [c.13] Теоретические основы определения объема газового пространства манометрическим методом сводятся к следующему. [c.13] Если объем газа в газовом пространстве при атмосферном давлении Р равен У+х, то при сжатии этого объема до величины V (т. е. при уменьшении объема на величину х) давление в замкнутой системе повысится до (Р + /г,). [c.13] Определение Лг. Чистый и сухой сосудик заполняют дистиллированной водой комнатной температуры с таким расчетом, чтобы вода примерно на 0,5 см не доходила до края его притертой поверхности. Точный объем внесенной в сосудик воды записывают. При этом необходимо внимательно следить за тем, чтобы в сосудике не оставалось пО стенкам пузырьков воздуха. На шлиф манометра наносят тонкий слой специальной смазки (вазелин с каучуком или ланолин), сосудик притирают к шлифу манометра и укрепляют резиновыми колечками. Поверхности шлифов должны быть прозрачными и не иметь полос в слое смазки. Оставляя краны открытыми, манометры укрепляют в соответствующих гнездах на боковой стенке термостата. Сосудики должны быть полностью погружены в воду. Определение проводят при комнатной температуре. [c.14] Пусть /12=130 мм (280—150) /11=45 мм (195—150) количество отобранной воды а=10 мл. Тогда объем газового пространства равен 0+Ух. [c.15] Вернуться к основной статье