ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Системы регистрации и обработки данных из "Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография" Существуют быстро сканирующие спектрофотометрические детекторы, которые позволяют снять УФ-спектр вещества при его прохождении через кювету без остановки потока. Один из наиболее удачных детекторов такого типа используют в хроматографе Милихром , в котором с помощью зеркала, поворачивающегося по заданной программе на определенный угол с заданной частотой, кюветы с образцом и сравнительная кювета освещаются последовательно монохроматическими лучами с выбранными оператором различными длинами волн. Получаемая при этом хроматограмма, представляющая собой комбинацию из двух, трех или более хроматограмм, снятых при разных длинах волн, позволяет получить качественную информацию о возможных примесях, замаскированных в одном пике, о природе и структуре вещества, о длине волны, при которой поглощение данного вещества максимально и можно определить его минимальное количество. Эта информация часто позволяет по одной хроматограмме решить сразу несколько достаточно сложных задач обнаружить примеси, установить чистоту веществ, определить длину волны, при которой поглощение каждого вещества наибольшее, провести идентификацию. Работать с таким детектором, конечно, сложнее, чем с простым спектрофотометром. [c.152] Существуют еще более усложненные спектрофотометры, например такие, которые позволяют, в соответствии с записанной программой, изменять длину волны для каждого пика или группы пиков таким образом, чтобы получить максимальную чувствительность. Длина волны при этом меняется автоматически несколько раз за время анализа. [c.152] В заключение хотелось бы подчеркнуть два положения. Применению спектрофотометров как универсальных детекторов, работающих при длинах волн около 200 нм, в большой мере препятствует очень малый выбор растворителей, УФ-прозрач-ных в этом диапазоне. Только тщательно очищенные ацетонитрил и вода могут использоваться в обращенно-фазном варианте при 200 нм и ниже. Получить такие высокочистые растворители очень трудно, и стоят они дорого. Еще труднее очистить для работы в этой области алканы (гексан, гептан и др.). [c.152] Дифференциальный рефрактометр непрерывно регистрирует изменение показателя преломления элюата на выходе из колонки. Главным достоинством этого детектора является универсальность, так как при выборе подходящего растворителя он может детектировать любые вещества. Поэтому он занимает второе место (после УФ-детектора) по частоте использования. К другим достоинствам рефрактометра относятся возможность работы с любыми растворителями в широком интервале скорости потока, невьюокие требования к чистоте подвижной фазы, надежность и удобство в эксплуатации. Некоторые модели детекторов могут работать при температуре до 150 С, что является исключительно важным для эксклюзионной хроматографии ряда синтетических полимеров. [c.153] Рефрактометр представляет собой недеструктивный концентрационный детектор средней чувствительности. Последняя определяется разностью показателей преломления элюента и анализируемых веществ и часто может быть повышена за счет правильного выбора подвижной фазы. В оптимальных условиях предел обнаружения для рефрактометра достигает 5 10 г/мл. Основные недостатки рефрактометрических детекторов— практическая невозможность использования при градиентном элюировании и необходимость тщательной стабилизации температуры. Для работы на максимальной чувствительности нужно поддерживать температуру элюента и обеих ячеек кюветы, с точностью до 10 -10 °С, что затруднительно даже при помещении кюветы в металлический блок с большой теплоемкостью и использовании эффективных теплообменников. Последние, в свою очередь, увеличивают мертвый объем между колонкой и кюветой детектора, что приводит к дополнительному размыванию хроматографических зон и снижению эффективности разделения. [c.153] Рефрактометры весьма чувствительны к пульсации потока,. поэтому при работе с этими детекторами необходимо применять демпфирующие устройства. [c.153] Промышленность производит рефрактометрические детекторы трех типов, различающиеся принципами измерения. [c.153] Рефрактометр оптического отклонения — наиболее распространенный тип данного прибора. Принцип действия детектора основан на том, что при прохождении луча света через кювету, заполненную двумя жидкостями с различными показателями преломления, луч отклоняется на утоп, пропорциональный разности этих показателей преломления. [c.153] Рефрактометр оптического отклонения может работать с любыми растворителями и имеет широкий диапазон линейности. Вместимость кюветы обычно равна 10 мкл, а порог чувствительности составляет 5 10 °-2 10 ед. рефракции. К этому типу принадлежат широко известный рефрактометр Р401 фирмы Уотерс и уникальный лазерный рефрактометр ЛР-1 [24] с вместимостью кюветы всего 0,1 мкл. [c.154] Рефрактометр Френеля. Действие данного детектора основано на законе Френеля, который гласит, что количество света, отраженного от поверхности раздела двух веществ (жидкости и стекла), пропорционально разности показателей преломления этих веществ и углу падения света на поверхность раздела. Для получения максимальной чувствительности угол отражения должен быть близок к критическому. Основой конструкции рефрактометра Френеля (рис. 8.13) является стеклянная призма 7 с углом при вершине 90°, основание которой является верхней стенкой кювет. Измерительная и сравнительная щелевидные кюветы образованы отверстиями специальной формы в тонкой прокладке из фторопласта, зажатой между основанием призмы 1 и зеркальной пластиной из нержавеющей стали 2 (нижняя стенка кювет), которая одновременно является теплообменником. Проектор 3 вырабатывает два параллельных пучка света, которые сфокусированы на поверхности раздела стекла и жидкости в рабочей и сравнительной кюветах 4. Световой поток в кюветах проходит через тонкий слой жидкости и отражается от пластины 2. Отраженный свет фокусируется линзами 5 на измерительное и сравнительное фотосопротивления 6. Разностный сигнал усиливается электронным усилителем. [c.154] Проектор 3 смонтирован на отдельной оптической скамье, которую можно поворачивать для изменения угла падения и поддержания угла отражения, близким к критическому. [c.154] Главным достоинством рефрактометра Френеля является малая вместимость кюветы — 3—5 мкл, что позволяет принять его в сочетании с современными высокоэффективными колонками. [c.154] Основным производителем рефрактометров Френеля является фирма ЬОС (детекторы типа Рефрактомонитор ). [c.154] Интерферометрический рефрактометр относительно недавно разработан фирмой Оптилаб (Швеция) и выпускается только разработчиком. Он представляет собой интерферометр с двумя Проточными кюветами, который измеряет разность показателей Преломления в единицах длины световой волны. По данным фирмы, у этого детектора очень высокая линейность сигнала, а чувствительность на порядок выше, чем у других дефрактометров. Однако небольшой опыт работы с этим детектором показывает, что для получения стабильной нулевой линии требуется очень тщательное термостатирование всей хроматографической системы, и полностью реализовать его высокую чувствительность практически не удается. [c.155] Детектирование по флуоресценции применяют в биологии, медицине, форма-кологии, при анализе пищевых продуктов и контроле загрязнения окружающей среды. Флуоресцентными свойствами, т.е. способностью излучать свет (в видимой области спектра) под действием ультрафиолетового излучения, обладают многие биологически-активные вещества лекарства, витамины, стероиды. Красители, соединения с сопряженными связями, в том числе полиядерные ароматические углеводороды, также можно определять с помощью флуориметрического удетектора, при этом чувствительность определения велика. [c.155] Интенсивность флуоресцентного излучения зависит от интенсивности возбуждающего излучения и квантового выхода процесса возбуждения. Поэтому для повышения чувствительности метода следует использовать достаточно мощные источники света, например газоразрядные лампы или лазеры. Применение лазеров позволяет детектировать количество вещества на уровне 10 г. Метод двухфотонного лазерного возбуждения отдает возможность использовать лазер с более низкой энергией, например, аргоновый. Для внедрения в практику такого метода необходимо иметь достаточно широкий спектр лазеров, перестраиваемых по длинам волн. Чувствительность детекторов по флуоресценции для некоторых соединений оказывается на несколько порядков выше чувствительности детекторов по поглощению, поскольку отсчет удается вести фактически от интенсивности регистрируемого излучения, близкой к нулю, на которую не накладывается возбуждающее излучение. [c.155] Разработаны детекторы, которые могут одновременно работать и как спектрофотометры и как флуориметры. Детекторы с монохроматорами, позволяющими выбрать необходимые длины волн для возбуждающего и флуоресцентного излучения, обеспечивают высокую чувствительность и селективность, однако они оказываются значительно более дорогими, чем флуориметры с постоянной спектральной полосой. Одним из надежных флуориметров является детектор Кратос . [c.155] В качестве причин уменьшения чувствительности детекторов следует указать на поглощение излучения при высокой концентрации вещества в ячейке, а также на потерю излучения за счет отражения от окошек ячейки. Поэтому при работе с флуо-риметром следует использовать достаточно разбавленные растворы, кроме того, возможно применение детекторов без окошек, например с Не—Сс1-лазером. [c.155] Некоторые нефлуоресцирующие соединения разделяют в виде производных с флуорогенными веществами. Производные получают до хроматографического разделения или после, вводя реагент в Т-образное устройство между колонкой и детектором. Амины и фенолы образуют диазильные производные при взаимодействии с 5-диметил-амино-1-нафтилсульфохлоридом до разделения, а аминокислоты после разделения обрабатывают флуорескамином. [c.155] Перед количественным измерением необходимо убедиться в отсутствие фоновой флуоресценции, эффектов гашения и проверить отклик детектора на реальный образец. [c.156] Вернуться к основной статье