Плазмидные ДНК выделение

В гл. 15, посвященной плазмидам, описаны важнейшие методы выделения и характеристики молекул ДНК плазмид. Эти методы постоянно улучшаются, а для некоторых систем они публикуются здесь впервые (например, выделение плазмидной ДНК с большой молекулярной массой). [c.6]

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК С БОЛЬШОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ [c.136]

Препараты плазмидной ДНК, выделенные из дрожжей, можно использовать для рестрикционного анализа, а также для трансформации клеток Е. соИ с целью амплификации плазмиды. Эти процедуры описаны в табл. 7.8. [c.231]

Методами генной инженерии удается объединить в одном геноме антигены многих вирусов, например, гриппа и бешенства, герпеса и гепатита В. Клетки, зараженные одним вирусом, приобретают временный иммунитет к заражению другим вирусом - такое явление называется интерференцией. Это сложный процесс, определяемый многими факторами, в том числе и синтезом в клетке специального белка - интерферона. До сих пор интерфероны выделяли из крови животных или из донорской крови, что являлось сложным и дорогим методом. Генноинженерный способ получения интерферона (выделение его гена и клонирование в плазмидных векторах) позволил практически решить проблему достаточного обеспечения интерфероном больных гриппом даже во время эпидемий. [c.62]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Чтобы подтвердить потерю плазмид, проводят выделение и фракционирование ДНК по известным методикам (метод выделения плазмидной ДНК см. в гл. 15) и убеждаются в отсутствии плазмидной ДНК в клетках излеченного штамма. [c.25]

В настоящей главе описываются главным образом те методы, которые успешно зарекомендовали себя в моей лаборатории. Методы выделения и характеристики плазмидных ДНК рассмотрены в гл. 15. [c.112]

Важным этапом работы по генетической трансформации растений является выделение и клонирование генов, создание на их основе векторов для переноса чужеродных генов из клеток-доноров в клетки-раципиенты. Использование плазмидных, транспозонных, вирусных, пневмобалли-стических и других векторных систем позволяет исследователям осуществлять трансформацию растительных генотипов и получать трансгенные (модифицированные) растения с заданными или близкими к ним свойствами и качественными характеристиками. [c.422]

Анализу предполагаемых трансформантов обычно придается большое значение, и мы не остались в стороне от этой проблемы и разработали несколько соответствующих методик. Не нужно объяснить, насколько важно определить, являются ли колонии, отобранные как трансформанты, на самом деле трансформантами или же это ревертанты. Анализ трансформантов предполагает гибридизацию с колониями или выделение и анализ плазмидной ДНК. Кроме того, для оценки экспрессии чужеродного гена в дрожжевой системе весьма важно определить копийность плазмиды как фактор, оказывающий существенное влияние на уровень экспрессии. [c.230]

Таблица 10.9. Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной и бактериальной ДНК [c.88]

Если искомый ген кодирует продукт, без которого мутантная клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку можно создать методом трансформации мутантных клеток. Клетки, выросшие в отсутствие необходимого субстрата на минимальной среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмидного вектора. В разных вариантах этот подход использовали для выделения многих важных генов, в частности генов, ответственных за синтез антибиотиков и образование азотфиксируюших клубеньков на корнях некоторых растений. [c.70]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10-30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержагцего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комгглементиру-ющий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. [c.259]

Метод репликации функциональной ДНК, включающий трансформацию в подходящих условиях соответствующих одноклеточных организмов с помощью функциональной ДНК с целью получения трансформантов, при этом функциональная ДНК получена in vitro следующим образом а) расщеплением вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, совместимой с указанным одноклеточным организмом, с получением линеаризованного фрагмента, содержащего интактный репликон и концевой участок с заранее заданными свойствами б) объединением первого линеаризованного фрагмента со вторым, чужеродным по отношению к указанному одноклеточному организму и содержащим по меньщей мере один интактный ген и концевой участок, способный к лигированию с концевым участком первого линеаризованного фрагмента, причем по меньшей мере один из линеаризованных фрагментов содержит ген определенного фенотипического признака в условиях, подходящих для такого объединения, причем концевые участки первого и второго фрагментов объединяются с образованием функциональной ДНК, способной к репликации и транскрипции в указанном одноклеточном организме выращивание указанного одноклеточного организма в подходящей питательной среде и выделение трансформантов, обладающих данным фенотипическим признаком, проявление которого обусловливается У указанной функциональной ДНК. [c.540]

Трансформация — это процесс переноса генетической информации. при котором ДНК. выделенная из клетки-донора, поступает в клетку-реципиент. Реиипиентная клетка, в которой происходит экспрессия генетического материала донора, называется трансформантом. Трансформация может осуществляться как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Процесс, при котором выделенная ДНК фагов поступает в бактериальные клетки и обусловливает образование в них зрелых фаговых частиц, называется трансфекцией. [c.115]

Внесение разрыва в один из участков кольцевой плазмидной ДНК преврашает ее в линейную молекулу, как показано на рис. 19.1. Затем два конца этой молекулы могут быть присоединены к концам линейной молекулы чужеродной ДНК, что приводит к образованию кольцевой гибридной плазмиды. Формально не сушествует ограничений на длину встраиваемой в плазмиду чужеродной ДНК. Гибридная плазмида может сушествовать в бактериальной клетке неограниченно долгое время. Для выделения гибридной плазмиды из клетки, например с помощью гель-электрофореза, можно использовать такие ее свойства, как размер или кольцевое строение. [c.237]

Свойства кольцевых молекул ДНК могут быть использованы при разработке подходов к выделению промежуточных рекомбинационных структур. До сих пор мы рассматривали рекомбинирующие двухцепочечные ДНК как линейные молекулы, хотя многие геномы (особенно вирусные и плазмидные) имеют кольцевую структуру. На рис. 35.4 изображены последствия реципрокной рекомбинации между гомологичными сайтами на двух кольцевых молекулах ДНК. Увеличенная часть рисунка показывает, что в месте соединения эта структура не отличается от той, которая изображена на рис. 35.2, за исключением того, что концы каждой двухцепочечной родительской ДНК соединены. Этот факт имеет важные топологические последствия. Разделение такой структуры при рекомбинации ведет к образованию димерного кольца, содержащего две исходные родительские последовательности, соединенные по типу голова к хвосту . [c.447]

Хромосомную ДНК штаммов донора, таких, как штамм 1 (табл. 14.1), лучше всего выделять по методу Мармура ([29] разд. 22.2.1). Для получения активных в отношении трансформации препаратов ДНК последние этапы выделения, на которых удаляются остатки РНК, проводить не обязательно. ДНК плазмиды рУА13 можно выделить из штамма 1 и использовать для трансформации. Плазмидную ДНК выделяют методами, описанными в гл. 15. [c.77]

Многие методы, применяемые в настоящее время для выделения плазмидной ДНК, основываются на ее су-перспиральной ковалентно замкнутой кольцевой структуре. Согласно всем этим методикам, необходим лизис [c.128]

Существует много способов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Приводимая нами методика проста и вполне воспроизводима, но ее почти всегда можно заменить на другую. Мы описываем процедуру наработки космид Лориста — производных фага Я. Для других космидных векторов при необходимости можно ввести небольшие модификации. [c.60]

Представляется возможность не только отбирать специфические космидные клоны из космидных библиотек, но и использовать специфические космиды для выделения клонов из сложных плазмидных библиотек. Этот подход можно использовать и для выделения клонов кДНК, содержащих последовательности, кодируемые вставочным фрагментом данного космидного клона. [c.84]

Определить количество копий плазмиды в клетках трансформированного штамма можно разными методами, но все эти. методы предполагают выделение суммарной дрожжевой ДНК с последуюш,им определением соотношения плазмидной и геномной ДНК. Относительно простой способ оценить число копий высококопийной плазмиды — сравнение интенсивности окрашивания бромидом этидия рестрикционных фрагментов, соответствующих плазмидной ДНК и ДНК рибосомных повторов в суммарной геномной ДНК. Если суммарную ДНК из трансформированных дрожжей обработать рестриктазой, расщепляющей плазмиду и выщепляющей рибосомный повтор, соответствующие рестрикционные фрагменты можно визуализировать, окрашивая бромидом этидкя агарозный гель после электрофореза. В УФ-свете эти полосы отчетливо высвечиваются над фоновым свечением всех остальных окрашенных бромидом этидия гетерогенных по длине рестрикционных фрагментов. В ДНК гаплоидной дрожжевой клетки содержится приблизительно 140 копий рибосомных последовательностей, содержание же плазмидной ДНК может быть оценено количественно при помощи денситометриче-ск го сканирования фотонегативов, полученных при съемке геля. Интенсивность окрашивания нормализуют относительно длины [c.232]

Молекулы плазмидных ДНК могут обнаруживаться как в кольцевой, так и в линейной двухиепочечных формах. Нативная плазмидная ДНК, выделяемая из клеток с помощью мягких методов, представляет собой сверхскрученные ковалентно замкнутые кольцевые молекулы. Если происходит разрыв одной нити ДНК, возникают открытые кольцевые, или релаксирован-ные, молекулы. При двунитевых разрывах образуются линейные формы (рис. 10). Огромные молекулы ДНК хромосом при разрушении клеток обычно многократно разрываются и образуют линейные фрагменты. Один из методов выделения плазмид- [c.87]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология