Анализ аминокислотной последовательности

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

Двумерное разделение пептидов, наиример гидролизатов белков, на целлюлозных н силикагелевых пластинках, где в одном (чаш е первом) направлении используется электрофорез в тонком слое (ТСЭ) при кислом pH буфера, а во втором — распределительная ТСХ. Оно применяется как для целей идентификации и сопоставления родственных белков (например, для выявления мутационных или патологических изменений), так и в качестве препаративного метода для последуюш,его анализа аминокислотной последовательности в пептидах. [c.460]

В принципе возможен систематический анализ любой системы иммуноглобулин — лиганд. Исследование моделей связывания может проводиться систематическим образом, поскольку у млекопитающих, например кроликов или коз, синтез антител может индуцироваться по отношению к любой специально подобранной молекуле (с низкой или высокой молекулярной массой). Используя аффинную хроматографию, получаемые антитела затем очищаются. Как правило, эта процедура приводит к вырожденному иммунному ответу, т. е. к синтезу нескольких видов антител несколькими клонами так называемых клеток плазмы (542]. Эти антитела отличаются константами сродства к лиганду, что проявляется также в химических, спектральных и иммунологических свойствах центров связывания. Последующие анализы аминокислотной последовательности показали, что различия вызваны аминокислотными заменами в гипер-вариабельных областях доменов /ь и Ун [622]. На первый взгляд кажется, что вырожденный ответ должен усложнить пространственную организацию центров связывания. В действительности, однако, в этом случае возможно объединить и взаимно контролировать данные по нескольким центрам связывания, что заметно увеличивает вероятность нахождения правильных моделей. [c.245]

Использование протеаз с различной специфичностью и проведение химического гидролиза пептидных связей по разным аминокислотным остаткам позволяют получать перекрывающиеся фрагменты, анализ аминокислотной последовательности которых дает возможность определять первичную структуру целого белка. [c.139]

Анализ аминокислотных последовательностей компонентов активной фракции обнаружил наличие в полипептидных цепях повторяющегося участка -Ala-Ala-Thr- с двумя дополнительными остатками аланина на С-конце полипептидной цепи. Для этих белков предполагается гибкая вытянутая структура, образующая в воде неидеальные и нерегулярные формы и тем самым нарушающая нормальный рост кристаллов льда. Гидрофильная [c.429]

В историческом плане именно глобины определили появление идей о специализации и дифференциации белков. Еще в 1865 г. была выдвинута гипотеза, по которой глобины мышц [551] и глобины красных кровяных телец [552] представляют собой идентичные или родственные белки. Почти через 100 лет рентгеноструктурный анализ гемоглобина [553] и миоглобина [185] показал, что для обоих белков характерен особый способ свертывания цепи, так называемое свертывание типа глобинов (рис. 8.4). По данным анализа аминокислотной последовательности миоглобина [554] и гемоглобина [553], завершенного несколько позже, различие между ними составляет около 73% (192 РАМ). [c.222]

Таким образом, уже на первых объектах анализа трехмерной структуры было установлено, что укладка цепи может сохраняться в высокой степени. Кроме того, стало очевидным, что белки, выполняющие различные функции, существующие в разных тканях н в разных организмах, могут иметь большое сходство и, следовательно, одинаковое происхождение. Эти факты явились важными стимулами к использованию структурного анализа белков, и в особенности анализа аминокислотной последовательности, для изучения эволюции на уровне макромолекул [145]. [c.222]

Определение аминокислотной последова- Автоматический анализ аминокислотной последовательности белков тельности в белках [c.247]

Б. МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ БЕЛКОВ [c.31]

Разделение смесей аминокислот и пептидов имеет исключительно важное значение при анализе аминокислотной последовательности белков. Зональный электрофорез, вообще говоря, не позволяет за один прием разделять сложные смеси из 10—20 авш-нокислот. В таких случаях предварительно проводят разделение [c.104]

Изложенный выше метод управляемого протеолиза играет существенную роль в анализе аминокислотной последовательности высокомолекулярных белков. [c.36]

После появления секвенатора время анализа аминокислотной последовательности белка стало определяться стадией очистки [c.128]

Анализ аминокислотной последовательности пептвдов и белков этим методом может выполняться вручную или с помощью специальных автоматических приборов — секвенаторов, использование которых в настоящее время значительно упростило процесс аминокислотного анализа. В сек-венаторах белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается реакции по Эдману. Реактивы и растворители проходят над иммобилизованной белковой пленкой, а высвобождающиеся ФТГ-АК подвергаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом идентифицируются. С помощью сек-венатора можно определить аминокислотную последовательность полипептида или белка, содержащего до ста аминокислотных остатков. [c.60]

Белковым компонентом ряда ДНП-частиц, например спермы рыб, являются протамины — низкомолекулярные основные белки (мол. в. 4000—12 ООО), характеризующиеся высоким содержанием аргинина (70 — 80%). По сравнению с другими белками протамины имеют ограниченный набор аминокислот (аргинин, аланин, серин, пролин, треонин, лизин, гистидин). Структура ДНП-частиц, содержащих протамины, — нуклео-протаминов предложена на основании данных рентгеноструктурного анализа и анализа аминокислотных последовательностей [c.457]

Бернет считал, что такое разнообразие вызывается мутациями в определенной линии клеток крови в ходе эмбрионального и постнатального развития животного. После того как была выяснена четвертичная структура и природа изменчивости молекул антител, теория Бернета была перефразирована следующим образом мутации, которые селекционирует антиген, возникают в генах, определяющих структуру легких и тяжелых цепей антител, причем в той части этих генов, которая соответствует вариабельным участкам полипептидных цепей. На фиг. 255 представлены результаты анализа аминокислотной последовательности вариабельного фрагмента легкой цепи у различных молекул антител человека. Видно, что эти данные очень напоминают аминокислотные замены, обнаруженные у мутантов по белку оболочки вируса табачной мозаики (фиг. 217). Легкие цепи отличаются друг от друга по разным положениям полипептидной цепи, и если сопоставить эти различия с таблицей генетического кода (табл. 27), то видно, что все они могут быть объяснены заменами одиночных оснований в триплетах. Таким образом, характер изменчивости первичной структуры белков антител находится в соответствии с мутационной гипотезой Бернета. [c.521]

Часто бывает целесообразно отдельные более крупные пептиды подвергнуть дальнейшему расщеплению одним из перечисленных выше методов и определить затем аминокислотную последовательность полученных фрагментов. Если удается установить последовательности для всех пептидных фрагментов одной группы, например фрагментов, полученных в результате трипсинового гид-ро.тиза, то определение аминокислотного состава фрагментов, полученных другим методом, как правило, позволяет исследователю составить рабочую гипотезу относительно взаимного расположения первой группы пептидных фрагментов. Правильность выдвинутой гипотезы можно проверить путем анализа аминокислотной последовательности некоторых фрагментов, полученных вторым способом. Так, например, перекрывание последовательностей, установленное при изучении многих аргинин- и лизин- [c.73]

Осуществленный таким способом гидролиз пептидньк связей-это необходимый шаг в определении аминокислотного состава белков и последовательности составляющих их аминокислотных остатков. Пептидные связи могут быть гидро-лизованы также под действием некоторых ферментов, таких, как трипсин и химотрипсин, представляющие собой протеолитические (белок-расщепляю-щие) ферменты, секретируемые в кишечник и способствующие перевариванию, т. е. гидролитическому расщеплению, белков, входящих в состав пищи. Если кипячение пептидов с кислотой или щелочью приводит к гидролизу всех пептидных связей независимо от природы и последовательности соединенных при их помощи аминокислотных звеньев, то трипсин и химотрипсин осуществляют каталитическое расщепление пептидов избирательным образом. Трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которьсс участвуют карбоксильные группы лизина или аргинина. Химотрипсин же атакует только те пептидные связи, которые были образованы с участием карбоксильных групп фенилаланина, триптофана и тирозина. Как мы увидим дальше, такой избирательный ферментативный гидролиз оказьшается очень полезным при анализе аминокислотных последовательностей белков и пептидов. [c.130]

Масс-спектроскопия приобрела особое значение при анализе аминокислотных последовательностей белков (разд. 3.6.1.2.2). Для определения фе-нилтиогидантоина используют масс-спектроскопию полевой десорбции ионов, причем применяется прибор высокого разрешения с фотодетектором. [c.65]

В последнее время для анализа аминокислотных последовательностей наряду с химическими широко используются различные физические методы. Шайиблат [134] определил последовательность некоторых ди- и трипептидов с помощью ЯМР. Метод основан иа изменениях спектра в зависимости от pH среды и последовательности пептида. [c.373]

Принципиально первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки ну1слеотидноп последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода. Естественно, наибольшую надежность обеспечивает сочетание этих методов. [c.33]

Они нековалентно ассощшрованы с небольшим белком-p2-JЦ <кpo-глобулитм, который кодируется геном, находящимся в другой хромосоме. Анализ аминокислотной последовательности этого белка (мол. масса 11500) показал, что он гомологичен отдельному домену иммуноглобулинов. Это указывает на эволюционную связь между гликопротеинами МНС класса I и иммуноглобулинами. В пользу такой связи свидетельствует, кроме того, найденная недавно гомология аминокислотных последовательностей между одной из петель (с дисульфидной связью) гликопротеинов класса [c.59]

Биологический смысл, заключенный в гомологии последовательностей, лучше всего можно проиллюстрировать на примере цитохрома с-железосодержащего митохондриального белка, участвующего в качестве переносчика электронов в процессах биологического окисления в эукариотических клетках. Молекулярная масса этого белка у большинства видов составляет около 12 500 при этом его полипептидная цепь содержит 100 или несколько большее число аминокислотных остатков. Бьии установлены аминокислотные последовательности для цитохромов с, выделенных более чем из 60 видов, и во всех исследованных белках 27 положений в полипептидной цепи оказались занятыми одинаковыми аминокислотными остатками (рис. 6-14). Это указывает на то, что все эти остатки играют важную роль в определении биологической активности цитохрома с. В других положениях аминокислотные остатки могут варьировать от вида к виду. Второй важный вывод, сделанный на основе анализа аминокислотных последовательностей цитохромов с, состоит в том, что число остатков, по которым различаются цитохромы с любых двух видов, пропорционально филогенетическому различию между данными видами. Например, молекулы цитохромов с лошади и дрожжей (эволюционно весьма далеких видов) различаются по 48 аминокислотным остаткам, тогда как цитохромы с гораздо более близких видов— курицы и утки-только по двум остаткам. Что же касается цитохромов с курицы и индейки, то они имеют идентичные аминокислотные последовательности. Идентичны также цитохромы с свиньи, коровы и овцы. Сведения о числе различий в аминокислотных последовательностях гомологичных белков из разных видов используют для построения эволюционных карт, отражающих последовательные этапы возникновения и развития различных видов животных и растений в процессе эволюции (рис. 6-14). [c.155]

К середине 60-х годов было показано, что белки антител не представляют никакого исключения из этого правила оказалось, что антитела против разных антигенов отличаются по последовательности аминокислот и что специфическая структура любого антитела четко определяется его аминокислотной последовательностью. Было показано, что молекула антитела обладает четвертичной структурой и состоит из двух пар одинаковых полипептидных цепей — пары легких цепей длиной примерно 200 аминокислот и пары тяжелых цепей длиной примерно 400 аминокислот (фиг. 254). Молекула антитела содержит два центра, комплементарных антигену, стерессиецифическая конформация этих центров обусловлена переплетением противолежащих участков одной тяжелой и одной легкой цепи. Анализ аминокислотных последовательностей молекул различных антител показал, что первые 100 аминокислотных остатков со стороны аминоконца как легких , так и тяжелых цепей составляют вариабельный участок, аминокислотная последовательность которого у различных антител различна. Остальные 100 аминокислот легких цепей и 300 аминокислот тяжелых цепей составляют постоянный участок мо- [c.519]

Анализ аминокислотной последовательности интересующего пептида методом ГЖХ базируется на частичном гидролизе (предпочтительно кислотном) в концентрированой соляной кислоте [10, 18] или 8,5 н. растворе хлористого водорода в абсолютном метаноле, проводящемся в запаянной ампуле при 70 °С в течение 5—17 ч [6,29]. В ходе деградации получаются все аминокислоты, а также возможные пептидные фрагменты от дипептидов до олигопептидов. Ясно, что они образуются не в одинаковых количествах, поскольку пептидные связи сильно отличаются по чувствительности к кислотному гидролизу. Если частичный гидролиз проводится в метанольном растворе хлористого водорода, продукты деградации получаются в виде хлоргидратов соответствующих эфиров для дальнейшего хроматографического анализа они нуждаются только в трифторацетилировании. [c.164]

Изучение первичной структуры этих полипептидов теми же методами, что были использованы для анализа аминокислотной последовательности инсулина (см. гл. III), показало, что они содержат по нескольку остатков лизина на своих аминоконцах и по одному остатку аспарагина на карбоксильных концах (фиг. 219). Таким образом было продемонстрировано, что трансляция этой искусственной информационной РНК происходит со стороны 5 -конца, содержащего кодоны ААА, в направлении З -конца, заканчивающегося кодоном ААЦ. [c.444]

Был получен Pho мутант Е. oti (дефектный по щелочной фосфатазе), содержащий ат-мутацию гене Phok. Из этого мутанта был получен набор Pho ревертантов, у которых восстановленне активности щелочной фосфатазы не было связано с действием супрессоров. Анализ аминокислотной последовательности белка щелочной фосфатазы этих ревертантов показал, что они содержат различные аминокислотные замены, показанные на схеме в том месте полипептидной цепи, где в белке дикого-типа находится остаток триптофана. Для каждой аминокислоты указаны ее кодоны-синонимы подчеркнуты те из них, которые связаны с УАГ одиночной заменой основания. Очевидно, что УАГ является единственным триплетом, из которого в результате одиночных замен может возникнуть хотя бы по одному кодону для каждой из семи аминокислот, обнаруженных в ревертантах. [c.456]

Физические и химические исследования бактериофага 2 показали, что его частица содержит одну одноцепочечную (некольцевую) молекулу РНК длиной около 3300 нуклеотидов. (Следовательно, РНК 2 несет примерно в два раза меньше генетической информации, чем РНК ВТМ.) Нуклеотидный состав РНК 12 следующий [А] = 0,23 [Г] = 0,26 [У] = = 0,26 и 1Ц] = 0,25. Белковая оболочка фага 2 представляет собой сферическую структуру из 180 одинаковых молекул белка, каждая из которых содержит 129 аминокислот. Анализ аминокислотной последовательности белка фага 12 и родственных ему фагов М52 (выделенного в Калифорнии) и 1г (выделенного в Германии) показал, что белок М52 отличается от белка 2.по 88.-й аминокислоте, белке фага 12 в этом мес е находится оста- [c.469]

Следует особо отметить, что установление аминокислотной последовательности белка имеет очень важное практическое значение. Так, например, причину возникновения серповидно-клеточной у новорожденных детей удалось установить при анализе аминокислотной последовательности белка гемоглобина, содержащегося в эритроцитах крови больных. Оказалось, что аномальный гемоглобин больных (HbS), в отличие от нормального гемоглобина (НЬА) здоровых людей, в 6-м положении полипептидной цепи вместо глутаминовой кислоты содержит валин [c.61]

Данные о природе мутаций со сдвигом рамки получены при анализе аминокислотной последовательности белков, которые кодируются генами, содержащими взаимно супрессирующие мутации рамки (см. гл. 12). На рис. 20.9 сравнивается аминокислотная последовательность лизоци-ма фага Т4 дикого типа с соответствующими последовательностями белков фаговых мутантов, несущих две мутации со сдвигом рамки. С помощью таблиц генетического кода мы можем восстановить ве- [c.14]

Выше мы предположили, что схема филогенеза нам была заранее известна (рис. 26.2). Однако на самом деле результаты исследований ДНК и белков можно использовать для реконструкции филогений в тех случаях, когда нет других источников информации или когда палеонтологические и иные данные допускают различное толкование. Поскольку между С и В намного меньше различий, чем между любым из этих видов и Е, можно предположить, что виды С и В возникли путем дивер-геш1ии позднее, чем вид Е. Таким образом, мы приходим к той же филогении, которая изображена на рис. 26.2. Реконструкция филогений не вполне надежна в тех случаях, когда она основана на результатах анализа аминокислотной последовательности какого-то одного белка или нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей этот белок, так ка,к в одних ветвях эволюции замены могли происходить чаще, чем в других, или в иное время. Однако данные, полученные при исследовании целого ряда белков у многих видов, обычно приводят к филоге ниям, хорошо соответствующим филогениям, реконструированным на основе морфологических и палеонтологических данных. [c.204]

Электрофорез оказывается бесполезным при сравнении организмов, находящихся в очень отдаленном родстве. Они электрофоретически различаются по всем или по большинству локусов. Поскольку число аминокислотных замен нельзя установить с помощью электрофореза (устанавливаются лишь различия в электрофоретической подвижности белков), этот метод непригоден для того, чтобы оценить степень дифференциации между видами в случае, когда они различаются по всем или почти по всем локусам. С другой стороны, метод электрофореза имеет то преимущество, что при его использовании оценка расстояния производится по данным о многих локусах поэтому различия в скоростях эволюции в разных эволюционных линйях по одному локусу могут быть компенсированы различиями по другим локусам. В целом электрофорез-это удобный метод, позволяющий оценивать генетические изменения у близкородственных организмов, у которых анализ аминокислотных последовательностей какого-то одного белка может не выявить никаких различий или различия оказываются такими незначительными, что это приводит к ошибочным результатам. [c.231]