Молекулярные векторы

Разработка методов генетической инженерии, позволяющих клонировать в составе молекулярных векторов отдельные гены любых организмов и вводить их в гетерологичное окружение клетки-реципиента, открыла прекрасные перспективы для решения такого фундаментального вопроса биологии, как экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке. [c.157]

Использование ПЦР для клонирования заданных фрагментов ДНК. Появление метода ПЦР значительно упростило процедуру точного извлечения из состава молекул ДНК известных нуклеотидных последовательностей и встройки их в молекулярные векторы. Могут быть рассчитаны последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые обеспечивают не только точную амплификацию требуемого фрагмента, но и одновременно позволяют вводить участки гидролиза определенных рестриктаз (рис. 1.34), необходимые для запланированной встройки в клонирующий вектор. При этом количество исходной ДНК, содержащей целевую последовательность, может быть очень малым. [c.54]

Частным слз аем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы. Это молекулярные векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках-реципиентах. [c.32]

В ряде слз аев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса. Такие молекулы ДНК называют интегративными векторами. [c.32]

Смесь молекул, полученных после встройки в выбранный молекулярный вектор фрагментов экзогенной ДНК, вводят в компетентные клетки. Если при этом в вектор статистически встраивают большой набор разных фрагментов донорной ДНК, то вероятность встройки каждого конкретного фрагмента невелика. В этом случае необходимо иметь методы, позволяющие в большом многообразии получаемых гибридных клонов выявлять необходимые. В связи с этим в генно-инженерном эксперименте большое значение имеют методы скрининга (отбора) клонов, содержащих целевые гибридные ДНК. [c.34]

Молекулярные векторы на основе ДНК фага лямбда [c.97]

Из одиннадцати пациентов доктора Фишера девятерых мальчиков (включая двоих, у которых теперь обнаружили лейкемию) лечили этим способом, причем их самочувствие при постоянном контроле все время было отменным. Когда поступило сообш ение о первом случае лейкемии, многие специалисты сочли это простым совпадением. Но доктор К. фон Калле из детской больницы Цинциннати (штат Огайо, США) отмечает, что анализ клеток в обоих случаях свидетельствует, что рак вызван, по всей вероятности, одним и тем же молекулярным сбоем молекулярный вектор (биологический переносчик) на основе ретровируса, использованный для доставки корректирующего гена в организм пациента, внедрился в тот участок его ДНК, где находится печально известный ген LM02, способный, по мнению специалистов, вызывать лейкемию у детей. Ученые сегодня убеждены — болезнь, признаки которой обнаружены у обоих мальчиков, настолько напоминает лейкемию, что пока решено классифицировать ее именно так. По оценкам доктора фон Калле, вектор локализуется рядом с геном LM02 с вероятностью примерно 10 т. е. дефектной оказывается по крайней мере одна из 100 тыс. клеток. А поскольку каждый из пациентов при таком методе лечения получал около миллиона скорректированных клеток, ясно, что некоторые из них могли оказаться дефектными . Фон Калле провел тщательное исследование анализов всех пациентов, которых лечили подобным образом (во всем мире их 15 человек), пытаясь обнаружить присутствие дефектных клеток. [c.134]

Таким образом, амплификация последовательностей ДНК in vitro находит широкое применение как в экспериментах по клонированию в составе молекулярных векторов, так и для прямого анализа вариантных состояний генов. Особое значение рассмотренный методический подход имеет при разработке простых тест-систем для выявления в организме нуклеиновых кислот инфекционных агентов. В настоящее время такие анализы стали рутинными. Многочисленные фирмы производят тест-системы для идентификации методом ПЦР (или ОТ-ПЦР) практически всех известных микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных. В частности, этот подход используют для ранней диагностики наличия в организме вируса имм шодефицита человека (HIV), что не удается осуществить другими методами. При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения фрагментов ДНК и окраски их бромистым этидием. [c.54]

Для фага А, часто используемого в качестве молекулярного вектора клеток Е. соИ, разработан метод упаковки ДНК in vitro в капсиды. Для этого требуются концентрированные экстракты клеток, индуцированных из лизогенного состояния. Использзтотся мутанты фага, имеющие дефекты по разным генам белков головки капсида. Каждый из таких мутантов не способен образовывать полноценные фаговые частицы и упаковывать свою ДНК. При смешении же фаговой ДНК и белковых экстрактов клеток, в которых развивались мутанты, происходггг комплементация недостающих функций и собираются инфекционные частицы. Биологическую активность эндогенной фаговой ДНК в экстрактах обычно подавляют УФ-облучением. [c.84]

Многие бактериальные молекулярные векторы основаны на высоко- или среднекопийных репликонах, которым часто свойственна структурная нестабильность встроенных фрагментов (см. гл. 8), сопровождаемая делегированием или перестройкой сегментов клонированных фрагментов ДНК. Особенно такая нестабильность характерна для протяженных фрагментов ДНК эукариотических организмов, поскольку они могут содержать различные семейства повторяющихся последовательностей. [c.108]

Уже первые эксперименты показали, что, увелряивая дозу бактериальных генов за счет клонирования их в многокопийных молекулярных векторах, удается значительно повысить в клетках Е. соИ продукцию белков, кодируемых этими генами (см. 3.1). В связи с этим встал вопрос о возможности использовать методы генетической инженерии для конструирования эффективных штаммов — продуцентов первичных метаболитов, таких как аминокислоты, витамины и др. Исходили из того, что повышение в бактериальной клетке уровня активности определенных ферментов (или одного фермента), контролирующих лимитирующие стадии биосинтетического пути выбранного первряного метаболита, может привести к суперсинтезу последнего. [c.167]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология