ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Синтез генов с помощью ПЦР из "Молекулярная биотехнология принципы и применение" На следующем этапе в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, Е и Р. 3 -конец олигонуклеотида Е идентичен 5 -концу олигонуклеотида С, а сам он отвечает участку реконструируемого гена, примыкающему слева к сегменту С. Аналогичными свойствами обладает олигонуклеотид Р, если его соотносить с олигонуклеотидом О. После денатурации и ре-натурации смеси образовавшиеся дуплексы с выступающими одноцепочечными участками достраиваются с 3 -гидроксильных концов. В ходе последующих раундов ПЦР образуется двухцепочечный продукт ЕСАВОР. [c.102] Следующие пары олигонуклеотидов - один достраивающий ген слева, другой справа -последовательно добавляют в смесь до тех пор, пока не будет синтезирован весь ген. Длина этих олигонуклеотидов обычно бывает равна 50 звеньям. Каждый блок ПЦР состоит из двадцати 4-минутных раундов. Для синтеза гена длиной 1000 п. н. нужно 10 блоков , так что ген можно получить в течение одного дня. При этом, как и в случае синтеза генов другими методами, последнюю пару нуклеотидов (т. е. 5 - и 3 -концы) можно снабдить дополнительными последовательностями, фланкирующими кодирующий участок и облегчающими последующее встраивание гена в вектор. [c.102] К числу наиболее важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР). [c.102] Для секвенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивают фрагмент ДНК длиной до 500 нуклеотидов, который хотят секвенировать. Эту рекомбинантную ДНК легко получить в одноцепочечной форме и использовать ее в качестве матрицы для секвенирования вставки. Можно использовать также двухцепочечные плазмиды, содержащие клонированную ДНК. [c.103] Вернуться к основной статье