Синтез генов с помощью ПЦР

Синтез генов с помощью ПЦР Получение генов с помощью ПЦР - гораздо более быстрый и экономичный метод, чем тот, который основан на отжиге олигонуклеотидов с перекрывающимися концами, заполнении брешей с помощью ДНК-полимеразы и сшивании разрывов ДНК-лигазой. В одной из методик конструирование гена начинается с отжига двух перекрывающихся олигонуклеотидов (А и В), отвечающих центральной части гена (рис. 5.24). После отжига образуется дуплекс с заглубленными 3"-гидроксильными группами, служащими точками инициации синтеза комплементарных цепей при ПЦР. Затем в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, С и [c.102]

Понятно, что это чудо химической и инженерной мысли решает все проблемы, связанные с искусственным синтезом гена. Из лоскутков по 20 нуклеотидов можно при помощи лигазы сшить ген любой длины. Это решает также проблему получения в больших количествах коротких кусков ДНК для их кристаллизации. Впрочем, такие машины появились в самом начале 80-х годов, но в конце 70-х в некоторых лабораториях, занимавшихся синтезом генов, уже умели быстро синтезировать лоскутки ДНК, правда, вручную. [c.135]

Эта область биохимии развивается с головокружительной скоростью. Редко проходит месяц без того, чтобы в биохимии не появилось сообщения о каком-нибудь крупном достижении или открытии. За расшифровкой генетического кода в начале 60-х годов последовала нескончаемая вереница захватывающих открытий и обобщений крупного масштаба. Среди них определение нуклеотидных последовательностей многих генов, искусственный синтез генов, соединение генов в новых сочетаниях, встраивание генов одних видов в клетки других видов и получение с помощью таких измененных клеток продуцентов многих новых белков, полезных для тех или иных целей. Без преувеличения можно сказать, что в биохимической генетике началась новая эра, которая несомненно окажет в будущем существенное влияние на здоровье и жизнедеятельность человека. [c.851]

В 1970 г. Корана осуществил синтез гена из 10-звенных фрагментов, используя 2-й путь (с помощью лигазы). Копии (т-РНК) не удается получать. [c.697]

Крупные успехи в самое последнее время достигнуты и в синтезе ДНК. Корана (США) в 1970 г. завершил синтез ДНК, соответствующей ала-нин-транспортной РНК (при помощи этой ДНК в организме идет биосинтез аланин-т-РНК). Таким образом, произведен первый синтез гена. [c.318]

Рис. 1.58. Схема синтеза гена Rev HIV-2 с помощью ПЦР на синтетических полинуклеотидах

К этому направлению научно-технического прогресса следует относиться особенно осторожно. Существует мнение, что биотехнология может внести решающий вклад в решение глобальных проблем человечества. Однако даже с помощью обычной гибридизации — близкородственного скрещивания — получают, по сути, уродов, пусть и с полезными для цивилизации свойствами. С помощью же генной инженерии оказалось возможным создавать структуры ДНК, которых никогда не существовало в биосфере (в химии аналог — ксенобиотики) генная инженерия, таким образом, разрушает барьер, разрешающий генетический обмен только в пределах одного биологического вида или близкородственных видов, позволяет переносить гены из одного живого организма в любой другой. Этот факт открывает перспективы создания, в частности, микроорганизмов и растений с полезными для цивилизации свойствами и таит в себе колоссальную опасность этического и экологического характера. Наиболее известный случай здесь — синтез и использование гормонов роста в животноводстве, приведшие к так называемому коровьему бешенству . [c.248]

С каждым годом все большее число разнообразных процессов микробиологического синтеза реализуется в промышленных условиях, Промышленная биотехнология становится новым перспективным направлением, открывающим необозримые горизонты использования продуктов биосинтеза микроорганизмов в народном хозяйстве. Увеличивается число биохимических заводов и комбинатов по производству уже освоенной продукции микробиологического синтеза — ферментных препаратов, витаминов, кормовых антибиотиков, аминокислот, микробиологических препаратов для борьбы с вредителями растений, кормовых дрожжей и др. Широким фронтом ведутся исследования по получению и технологии производства новых биологически активных препаратов, разрабатываемых с использованием современных достижений молекулярной генетики и генной инженерии. К перспективным задачам промышленной биотехнологии относится также реализация микробиологических процессов, направленных на решение энергетической проблемы, в том числе производство биогаза, топливного этанола, метана, топливного водорода с помощью фотосинтезирующих микроорганизмов и др. [c.3]

Рис. 5.24. Синтез генов с помощью ПЦР. Перекрывающиеся олигонуклеотиды (А и В) отжигают и достраивают образовавщийся дуплекс с заглубленными 3 -гидроксильными концами. Двухиепочечные молекулы денатурируют, добавляют в реакционную смесь вторую пару олигонуклеотидов (Си О), перекрывающихся с продуктами первого раунда ПЦР, и отжигают. Осуществляют второй раунд ПЦР, добавляют следующую пару олигонуклеотидов (Е и Р), осуществляют третий раунд ПЦР и т. д. В результате образуется двутсцепочечная ДНК, идентичная искомому гену. Одинаковыми буквами со щтрихом или без (А и А, В и В и т. д.) обозначены комплементарные участки ДНК. Нуклеотидная последовательность каждого олигонуклеотида соответствует таковой определенных сегментов ДНК.

Чтобы создавать рекомбинантные ДНК, несущие желаемый ген, необходимо прежде всего располагать этим геном. Для этого используют три основных способа. Во-первых, если известна первичная структура белка, получение которого желательно осуществить методами генетической инженерии, можно, основываясь на генетическом коде, построить нуклеотидную последовательность, программирующую этот белок, и осуществить химико-ферментативный синтез гена. Так, например, были осуществлены синтезы нескольких генов, кодирующих различные интерфероны. Во-вторых, можно выделить из тканей, в которых происходит экспрессия гена, информационные РНК, среди которых должна присутствовать и мРНК, кодирующая необходимый белок, провести с помощью обратной транскриптазы синтез комплементарной ДНК (сокращенно кДНК) и перевести ее в двунитевую структуру с помощью Д П<-полимеразы. Можно, наконец, вырезать желаемый ген непосредственно из ДНК того объекта, бело которого собираются продуцировать. Два последних подхода не дают сразу же индивидуального гена и требуют предварительного отбора из сложной смеси кДИК или фрагментов хромосомной ДНК. Эта проблема решается уяЛ на уровне илстои микроорганизмов, в которые введены новые наследственные программы, и пути ее решения будут изложены несколько ниже. [c.301]

Рис. 7. Схема синтеза гена транспортной РНК аланина по Коране. Вся двойная цепь ДНК разбита на 15 олигонуклеотидов, к-рые были синтезированы химически. На схеме видны липкие концы , соединяющие отдельные блоки, к-рые затем стыкуются с помощью полинуклеотидлигазы. В нижней строке показан др. вариант разбиения на блоки.

ДНК некоторых вирусов реплицируются в одном направлении по механизму катящегося кольца , вариант которого представлен на рис. 28-5. Вначале одна из двух цепей кольцевой родительской ДНК расщепляется ферментом. Затем к З -концу расщепленной цепи присоединяется несколько новых нуклеотидов. Рост новой цепи на кольцевой матрице осуществляется за счет постепенного вытеснения 5 -концевой части расщепленной цепи из катящейся кольцевой матрицы. По мере роста новой цепи вытесненный 5 -хвост становится линейной матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Этот синтез на линейной матрице продолжается до тех пор, пока не образуется дочерняя цепь ДНК, комплементарная одному обороту кольцевой матрицы. Двухцепочечный хвост отщепляется затем с помощью фермента, и на 5 -конце опять может начинаться процесс репликации. Таким путем с кольцевой матрицы может сходить множество комплементарных копий кольцевой ДНК. Механизм катящегося кольца испол ,зуется в ооцитах в процессе синтеза генов рРНК он позволяет получать большое число копий этих генов, расположенных в тандемной последовательности, что в свою очередь дает возможность синтезировать одновременно много рРНК. Этот механизм необходим ооцитам для того, чтобы производить много рибосом для быстрого синтеза клеточных белков в процессе ускоренно- [c.898]

Как уже описано, предпосылкой деградации ксенобиотиков в природной среде является присутствие в ней структурно родственных соединений. Природные механизмы сначала могут быть не эффективными в трансформации ксенобиотиков вследствие кинетических ограничений, вызванных субстратной специфичностью ферментов. Со временем это может быть преодолено за счет сверхпродукции этого фермента (ферментов), благодаря снятию или изменению регуляторного контроля его синтеза, генной дупликации, приводящей к дозовому эффекту, или мутационной изменчивости, создающей фермент с измененной субстратной специфичностью. Дальнейшая адаптация может произойти благодаря адаптивной пластичности микроорганизмов с помощью генетической перестройки. [c.331]

До недавних пор создание искусственного гена химическими методами было очень трудным делом. В настоящее время синтез искусственных олигонуклеотидов вполне обычен. Таким образом, технология для конструирования человеческих генов у нас в руках, и можно считать вполне ре-альньш в будущем синтез генов с любой желаемой последовательностью нуклеотидов и информационным содержанием. С помощью упоминавшихся выше фермен-тов-рестриктаз такие гены можно затем встраивать по желанию в любой геном. [c.167]

Ревертаза оказалась крайне неразборчивой в отношении субстрата своего действия — она при соблюдении некоторых вспомогательных условий способна копировать практически любые матрицы. А ведь создаваемая ревертазой цепь ДНК, по существу, представляет собой генный материал. Можно сказать, что при помощи ре-вертазы осуществляется ферментативный синтез гена. [c.175]

Химический и ферментативный синтез генов. Химический синтез гена впервые осуществил в 1970 г. Гобинд Хорана (США). В лаборатории этого ученого удалось химическим путем связать 77 дезоксирибонуклеотидов в цепочку ДНК, комплементарную к аланиновой транспортной РНК (г-РНК) пекарских дрожжей. Отрезки цепочки соединялись встык с помощью фермента лигазы. Две синтезированные нити соединялись химическими связями в спирализованную двутяжевую структуру. Такой искусственно созданный биополимер и стал геном аланиновой г-РНК, содержащейся в геноме дрожжей. Этот эксперимент — выдающееся достижение биоорганической химии. [c.166]

Однако с его помощью получить молекулы аланиновой г-РНК не удалось. Оказалось, что транспортные РНК синтезируются иа гене не в том виде, как они потом существуют в клетках, а в форме более длинной цепочки. Химический синтез гена технически очень труден и требует знания его нуклеотидной структуры. Возможности искусственного синтеза генов неизмеримо возросли в связи с открытием фермента обратной траискриптазы. При наличии матричной (информационной) РНК, соответствующей опре- [c.166]

В 1972 г. в ряде стран были начаты опыты по ферментативному синтезу гена, контролирующего образование глобина — белка, входящего в состав гемоглобина крови. В качестве матрицы использовали проверенную иа биологическую активность информационную РНК глобина из клеток человека, кролика и мыши. На этой ы-РНК, как на матрице, с помощью обратной траискриптазы строились соответствующие гены. Размер молекул полученной синтетической ДНК близко соответствовал и-РНК, служившей матрицей, и ожидаемой величине гена глобина. В качестве затравки использовали дезокситимидиловую кислоту (рис. 65). [c.167]

Умение индуцировать мутации в клонированных генах с целью получения мутантных белков лежит в основе белковой инженерии. При этом используют две группы методов, приводящих к разным последствиям на молекулярном уровне. Первая группа основана на случайном мутагенезе, т.е. введении в мутагенизиру-емый участок гена многих мутаций, положение каждой из которых не контролируется исследователем, а ограничивается лишь размером фрагмента нуклеиновой кислоты, в который эти мутации вводятся. Более или менее случайный мутагенез имеет место, в частности, при инкубации нуклеиновых кислот с химическими мутагенами или осуществлении их синтеза с помощью ДНК-полимераз с ослабленной специфичностью в отношении субстра-тов-предшественников. Совокупность этих подходов активно используется при проведении направленной эволюции белковых молекул. Вторая группа методов, получившая название направленного или сайт-специфического мутагенеза, обеспечивает введение мутаций в строго определенные участки нуклеиновых кислот, что позволяет заменять отдельные аминокислотные остатки в кодируемых этими молекулами белках и ферментах. Направленный мутагенез является сердцем (но не мозгом) рационального дизайна и редизайна белковых молекул, к рассмотрению которого мы сейчас переходим. [c.278]

В настоящее время, после завершения программы Геном человека , тысячи неизвестных ранее белков стали доступными для изучения. Чтобы выяснить их биологическую роль, необходимо экспрессировать соответствующие гены и выделить рекомбинантные белки. Проще всего использовать для этой цели последовательности природных генов, полученных, например, с помощью ПЦР или из геномных библиотек. Однако такой подход часто не приводит к желаемому результату при экспрессии чужеродных генов в гетерологичной системе, например в Е. oli или дрожжах. Такие осложнения связаны с высоким содержанием G -nap в природных генах, использованием разных кодонов в различных системах экспрессии, сложной интрон-экзонной структурой генов. Эти проблемы могут быть решены с помощью химикоферментативного синтеза генов. [c.59]

Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

Важно уяснить, что именно основания, пуриновые или пиримидиновые, являются носителями генетической информации, подобно тому как боковые цепи аминокислот определяют химические и функциональные свойства аминокислоты. Носитель наследственной информации — молекула ДНК — организована в клетке в структурные единицы — гены. Эти последние в свою очередь локализованы в особых структурах — хромосомах, которые находятся в ядре животных или растительных клеток. Именно ген содержит информацию, определяющую специфический признак цвет глаз и волос, рост, пол и т. д. Однако для описания на молекулярном уровне ген — довольно сложное образование, так как число молекулярных стадий при реализации конкретного признака может быть весьма велико. Отметим, что любой генетический признак реализуется с помощью белкового синтеза (структурного белка либо фермента), и введем понятие более простого элемента — цистрона. Цистрон определяют как часть ДНК, которая несет генетическую информацию (кодирует) о синтезе лищь одной полипептидной цепи. Хромосома содержит много сотен цистронов. Все количество ДНК, содержащееся в клетке, называется геномом. [c.108]

Открытие основных компонентов систем транскрипции и трансляции послужило важным стимулом в изучении механизмов регуляции этих процессов. В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно опубликовали схему регуляции синтеза белков на уровне транскрипции при помощи регуляторных белков, а в 1966 г. У. Гилберт и Б, Мюллер-Хилл впервые выделили такой белок. Кроме того, оказалось, что РНК-полимераза сама является регулятором генной активности (Р. Б. Хесин. 1962—1966). Эти работы привели к открытию основных регуляторных генетических элементов — промоторов и терминаторов транскрипции. [c.7]

Установлено, что три нуклеотида выбирают аминокислоту для включения в полипептидную цепь можно сказать, что ген представляет собой последовательность трехбуквенных слов (названных кодонами), составленных при помощи четырехбуквенного алфавита — А, Т, G, С для ДНК и аналогично А, U, G, С для РНК. Таким образом, 146 кодонов, 438 букв (плюс несколько кодонов, служащих сигналами начала и прекращения синтеза) должны составлять ген, кодирующий синтез -цепи гемоглобина, содержащей 146 аминокислотных остатков. Каждая молекула РНК производит сотни -цепей в зрелом эритроците имеется около 100 000 000 молекул гемоглобина. [c.461]

И ча с М,, Биологический код, пер, с англ,, М., 1971. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (генетич. инженерия), совокупность методов, позволяющих искусственно получать молекулы ДНК, содержащие генетич. информацию из двух или более источников любого биол. и (или) хим. происхожде-пия. Осп. этапы Г. и. I) фрагментация молекул ДНК из ра, л. источников (бактерий, вирусов, культуры клеток, ткапей, целых организмов), обычно с помощью рестрикта-зы, или искусств. х1[мико-ферментативный синтез фрагмента ДНК 2) расщепление с номогцью этого же фермента молекулы ДНК (вектора), способной автономно реплицироваться в клетке (обычно это плазмидная или вирусная ДНК) 3) соединение фрагментов ДНК с вектором в еди- [c.125]

Важную информацию удалось получить при изучении процесса репликации прн помощи генетических методов [196, 198]. Была получена серия температурочувствительных мутантов Е. соИ. не способных к синтезу ДНК. С их помощью в разных точках хромосомной карты удалось идентифицировать гены dnaA, В, С, D, Е, F и G. Продукты генов А [c.276]

Наши современные представления о механизмах действия и регуляции генов, а также возможности частичного переноса ДНК от одной бактерии к другой позволяют предпринимать попытки к исправлению генетических дефектов за счет введения людям новых генов. На первый взгляд такая идея может показаться явно фантастичной, однако уже сейчас нам известны вирусы типа SV40, способные включаться в геном животных. Хотя вирус SV40 по своей природе онкогенен, тем не менее можно надеяться получить 8У40-подобные частицы ДНК с нормальными генами, извлеченными (возможно, с помощью других вирусов) из культивируемых клеток. Другая возможность решения этой проблемы состоит в извлечении генов из бактерий или же в введении генов, полученных химическим синтезом, в трансдуцирующие вирусы. [c.294]

Синтез. Биосинтез Б. происходит в результате трансляции в субклеточных частицах-рибосолшх, представляющих собой сложный рибо-нуклеопротеидный комплекс. Информация о первичной структуре Б. хранится в соответствующих генах-участках ДНК-в виде последовательности нуклеотидоа В процессе транскрипции эта информация с помощью фермента-ДНК-зависимой РНК-полимеразы - передается на матричную рибонуклеиновую к-ту, к-рая, соединяясь с рибосомой, служит матрицей для синтеза Б. Выходящие из рибосомы синтезированные полипептидные цепи, самопроизвольно сворачиваясь, принимают присущую данному Б. конформацию, а также подвергаются модификации благодаря р-циям разл. функциональных групп аминокислотных остатков и расщеплению пептидных связей (см. Модификация белков). [c.253]

Совр. методы хим. синтеза Н.к. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методич. основы хим.-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают 1) хим. сиитез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из к-рых затем в результате комплементационных взаимод. выстраиваются дуплексы-фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетнч. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в неск. этапов (рис. 4). Сначала (а) [c.299]

Смотреть страницы где упоминается термин Синтез генов с помощью ПЦР: [c.496] [c.232] [c.613] [c.199] [c.8] [c.77] [c.315] [c.280] [c.478] [c.263] [c.461] [c.82] [c.189] [c.253] [c.257] [c.258] [c.278] [c.287] [c.518] [c.665] [c.624]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология