ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы микробиологического контроля лекарственных средств из "Физико-химические и биологические методы оценки качества лекарственных средств" В последние годы на смену биотестам in vivo на лабораторных животных приходят методы биотестирования in vitro с использованием антител, тканей-мишеней, иммобилизованных клеток-мишеней. [c.314] Качественное и количественное определение гормонов может основываться как на структурных, так и на функциональных особенностях их молекул. В зависимости от этого выделяются две основные группы методов. [c.314] Для проведения РИА гормонов, а также других лекарств или токсических веществ (возможности метода весьма широкие) необходимо иметь радиоактивно меченое исследуемое соединение и смесь сывороточных гамма-глобулинов, содержащих антитела к этому соединению. Идеальным случаем является использование чистых моноклональных антител, полученных с помощью гиб-рндомной методики. [c.315] Антитела — это белки, синтезируемые зрелыми формами В-лимфоцитов (В-клетками), которые возникают при дифференцировке стволовых клеток в костном мозге. Взрослый человек обычно способен производить до 10 —10 различных В-клеток. Каждая В-клетка может синтезировать единичный вид антител против какого-нибудь чужеродного соединения, называемого антигеном. [c.315] Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315] Антитела обеспечивают высокую специфичность радиоиммунологического метода, высокая же чувствительность обеспечивается использованием радиоактивного антигена. [c.316] Для описания сути метода обозначим антитело как АВ , а соответствующий антиген как лиганд Ь. Этим лигандом в нашем случае является гормон, а в принципе это могут быть любые лекарственные соединения пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты и другие вещества, к которым получены антитела. [c.316] Количество Ь определяется по калибровочной кривой, полученной в контрольном опыте. Для этого добавляют небольшую (аликвотную) часть образца к раствору, содержащему известное количество АВ и Ьр. Ь и Ьр могут конкурентно связываться с AB , образуя комплексы [Ь — АВ] и [1 — АВ]. [c.316] Количество каждого из образующихся комплексов определяется соотношением [Ь — АВ /[Ь — АВ ] = Ь/Ьр, т.е. чем больше Ь, тем меньше образуется [Ьр — АВ ]. После установления равновесия связанный материал отделяют от несвязанного. При этом количество связанного 1 можно определить непосредственно, измеряя радио ц тивность осадка, либо косвенным путем, измеряя радиоактивность свободного Ьр, после установления равновесия и вычитая его из первоначальной радиоактивности. [c.316] Сравнивая количество [Ьр — АВ ], образующегося в стандартных условиях, с известными концентрациями Ь и Ц, можно определить количество Ь в испытуемом образце. [c.316] В настоящее время зарубежные фирмы выпускают наборы реактивов для определения ряда гормонов и других лекарств имму-ноферментным методом, так называемые контрольно-измеритель-ные тесты (КИТы). Эти КИТы содержат стандартный раствор тестируемого лиганда, моноклональные антитела, фермент и необходимые реактивы для определения ферментативной активности. [c.317] Результаты РИА и ИФА коррелируют очень хорошо. Преимущество ИФА заключается в том, что отсутствует необходимость использования радиоактивных соединений, требующих специальных методов работы и лабораторной техники, а также более дорогостоящего оборудования и реагентов. Кроме того, метод ИФА зачастую требует меньше времени. [c.317] Ко второй группе относят функционально-специфические методы (или биотесты) определения биологической активности гормонов. Они основаны на сопоставлении действия гормонов на физиологические функции органов или клеток-мишеней. Благодаря функциональной специфичности ответа ткани-мишени, она будет узнавать только молекулы, обладающие по отношению к ней определенной биологической активностью, в то время как другие молекулы, даже с очень сходной структурой, никакого ответа в клетках-мишенях не вызовут и, следовательно, не будут определены с помощью данного биотеста. Необходимо отметить, что величина специфического ответа клеточной культуры на действие гормона пропорциональна количеству занятых рецепторов клеточной поверхности и поэтому зависит от концентрации биологически активного вещества в пробе, действию которого подвергают ткань-мишень. На практике при биотестировании сравнивают величины ответа ткани-мишени после инкубации с тестируемым и контрольным (стандартным) растворами. [c.318] В последние годы, благодаря быстрому развитию биотехнологии клеточных культур, стало возможным использовать иммобилизованные монослои клеток-мишеней в биотестах — высокочувствительных специфических системах, предназначенных для количественного определения ряда биологически активных веществ. Основные принципы, лежащие в основе метода биотестирования, иллюстрирует рис. 10.1. [c.318] Примером практического применения метода является разработанный в лаборатории Стефана Бидея (США) метод биотестирования тиреотропного гормона (ТТГ) с помощью иммобилизованных клеток щитовидной железы человека. Эти эксперименты позволили получить стандартный препарат бычьего ТТГ в качестве альтернативного вторичного стандартного препарата по отношению к менее доступным препаратам ТТГ человека в рутинных лабораторных биотестах. [c.319] Предполагают, что клетки в суспензии распределены равномерно, суспензии не содержат остатков тканей и клеточных агрегатов, что позволяет получать монослои с плотностью клеток, варьирующей в пределах 1—2 %. [c.319] Иммобилизация клеток на твердой подложке в многолуночных полистирольных платах создает идеальные условия для выполнения различных операций при биотестировании. Так, значительно упрощаются процедуры введения и удаления тестируемых и стандартных препаратов. При этом клеточный монослой практически не нарушается. Уникальная пространственная конфигурация клеток, организованных в монослои, способствует быстрому и одновременному действию гормона на все клетки, благодаря чему достигается почти одинаковый ответ всех клеток. Так как повторы культур во всех лунках структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувствительности и хорошей воспроизводимости результатов. Основное требование, предъявляемое к биотесту, заключается в том, что каждая отдельная доза гормона должна быть проверена на достаточном количестве объектов или повторов. Это требование полностью удовлетворяется при использовании иммобилизованных клеток единственного монослоя, поскольку в пределах одной и той же платы все инкубационные лунки, а следовательно, и все монослои находятся в одинаковых условиях с точки зрения температуры, влажности, концентрации Og в воздухе и состава питательной среды. [c.320] По данным о накоплении внутриклеточного ц-АМФ при действии стандартного и тестируемого препарата строят кривые зависимости доза—ответ и рассчитывают активность тестируемого препарата. [c.320] Иммобилизованные ферменты нашли применение в автоматическом анализе биологических субстратов и лекарственны средств. [c.320] В настоящее время препараты ферментов и их ингибиторов находят широкое применение для лечения и профилактики различных заболеваний. Однако методы анализа этих аутобиогенных препаратов не рассматривались в курсе фарманализа. [c.321] Вернуться к основной статье