ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге из "Физико-химические методы анализа" Метод хроматографии на бумаге впервые был применен для анализа смеси аминокислот (Мартин, Кондсен, Гордон, 1944 г.). В настоящее время известно большое количество методов, которые позволяют анализировать сложные смеси аминокислот. При этом используют различные растворители, различные методы проявления, одномерные и двухмерные хроматограммы и др. В данной работе предлагается один из наиболее простых методов разделения и определения смеси двух или трех аминокислот. [c.65] Приведенные значения могут изменяться в зависимости от сорта и структуры бумаги однако последовательность значений Uf сохраняется. Таким образом, для качественного анализа необходимо ставить опыты в данных условиях с чистыми исходными препаратами аминокислот. [c.65] Гистидин. . . Серии. ... Метионинсульфон а-Аланин. . . Тирозин. ... Метионин. . . Лейцин. ... [c.66] Из табл. 1 видно, что некоторые пары или даже системы из трех аминокислот можно разделить на одномерной хроматограмме, выбирая соответствующий растворитель. Так, в первом растворителе легко разделить, например, смесь лизина, метионинсуль-фона и лейцина между тем во втором растворителе эта смесь будет плохо разделяться. Наоборот, смесь лизина и гистидина нельзя разделить первым растворителем, но можно разделить при длительном хроматографировании со вторым растворителем. Наконец, некоторые трехкомпонентные смеси нельзя разделить, пользуясь только одномерной хроматограммой. Так, нельзя разделить указанными растворителями смесь тирозина, метионина и лейцина. В первом растворителе будут подниматься вместе тирозин и метионин, а во втором растворителе — метионин и лейцин. Названную смесь трех компонентов можно разделить при двухмерной хроматограмме. Можно также применять и другие растворители. [c.66] После проявления измеряют значения чтобы установить качественный состав смеси если необходимо, сравнивают со стандартами, полученными в этих же условиях из чистых препаратов. Для количественного анализа используют тот или другой вариант фотометрического метода. [c.67] В последнее время применяют метод, основанный на измерении коэффициента отражения пятен хроматограммы. Однако этот вариант трудно осуществить в условиях учебной лаборатории, так как необходимо получить пятна очень правильной формы, что требует большого опыта. Поэтому можно пользоваться вариантом, не требующим предварительной подготовки. Для этого вырезают окрашенные пятна, переносят кусочки бумаги в пробирки и заливают 50%-ным спиртом. При слабом нагревании окрашенное соединение переходит в раствор, который можно фотометрировать, сравнивая со стандартами известного содержания. [c.67] Успешное разделение и определение относительного содержания аминокислот в смеси вполне возможно, однако от работающего требуется большое внимание к технике эксперимента. [c.68] Подготовка к выполнению задачи. Выбирают равный по диаметру стеклянный цилиндр емкостью 100 или 200 мл, лучше без делений. К нему подбирают хорошую корковую пробку. После подготовки цилиндр тщательно моют и сушат. [c.68] На нижней стороне пробки укрепляют стеклянный крючок, на котором подвешивается бумажная полоска. Перед тем как приступить к работе, еще раз проверяют все устройство в сухом цилиндре, не наливая растворителя. При закрытой пробке бумажная полоска должна находйться близко ко дну цилиндра, но не касаться его упорная стеклянная палочка своей массой должна натягивать полоску так, чтобы она нигде не касалась стенок. [c.68] Прежде чем приступить к работе, обязательно необходимо научиться наносить на точно определенное место фильтровальной бумаги малые пробы жидкости. Для этого пользуются обрезками той же бумаги и хорошо оттянутым капилляром или микропипеткой общим объемом 0,1 мл (при длине порядка 10 см) с делениями на 0,01 и 0,001 мл. Во всех случаях необходимо нанести микрокаплю, так, чтобы на бумаге ее диаметр был около 3 мм. Во время вытекания жидкости из капилляра надо наблюдать не за изменением положения мениска в пипетке, а за размером пятна на бумаге когда пятно достигает необходимого размера, быстро отнимают пипетку и только после этого производят отсчет объема вытекшей жидкости. [c.68] Ход анализа. В пробирке готовят смесь -бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в объемных соотношениях 6 2 2. Для одного цилиндра достаточно 10 мл смеси. Осторожно, стараясь не касаться стенок, вносят растворитель в цилиндр. Далее прикладывают снаружи пробку с прикрепленной полоской бумаги, чтобы видеть приблизительно место уровня жидкости. Затем простым карандашом делают на бумаге метку для пятна испытуемого раствора на расстоянии приблизительно 5—8 см над уровнем, до которого будет погружена в растворитель бумага в цилиндре. Чтобы растворитель равномерно поступал на пятно исследуемого раствора, место нанесения капли должно быть на 2—5 см выше стеклянной палочки, вставленной в разрезы (см. рис. 31). Если наметить для испытуемого раствора место капли близко к уровню растворителя, то он быстро проходит через разделяемую смесь и после проявления пятна отдельных компонентов имеют неправильную форму. Если нанести каплю высоко, то увеличивается время опыта. Кроме того, при этом ухудшаются условия разделения, так как на полоске бумаги остается мало места для достаточного раздвижения отдельных компонентов. [c.69] Наносят микрокапли испытуемого раствора на отмеченное место бумажной полоски и подсушивают. Далее осторожно опускают бумажную полоску в цилиндр и хорошо закрывают пробкой. С момента соприкосновения бумаги с растворителем необходимо избегать перемещивания жидкости, перемещения цилиндра и т. п. [c.69] Опыт продолжается 2—4 ч, пока фронт растворителя поднимется на достаточное расстояние выше места нанесения капли испытуемого раствора, например на 10—15 см. После этого осторожно вынимают бумажную полоску из цилиндра, отмечают простым карандашом фронт растворителя и подсушивают полоску. Далее проявляют хроматограмму пульверизацией, например раствором нингидрина. [c.69] Подсушенную хроматограмму подвешивают перед листом белой бумаги или около вытяжного шкафа и при помощи стеклянного пульверизатора, погруженного в пробирку с раствором нингидрина, наносят его на хроматограмму. Не следует наносить большого количества раствора проявителя, так как это приводит к расплыванию пятен. Затем ожидают 20—30 мин при этом лучше поместить полоску над нагретой электроплиткой на достаточном расстоянии. [c.70] Когда проявление закончено и пятна ясно выражены, кладут хроматограмму на чистую бумагу, измеряют и записывают расстояние от середины пятен и верхнего фронта растворителя до места нанесения пятна испытуемого раствора. На основании этих данных рассчитывают значения Rf. [c.70] Для количественного определения вырезают окрашенные пятна (излишнюю бумагу отбрасывают) и переносят их в отдельные пробирки. В каждую пробирку прибавляют по 2 или 3 мл спиртового раствора нингидрина. Пробирки опускают на 10—15 мин в стакан с теплой водой. После вымывания окрашенного соединения определяют фотометрически содержание отдельных аминокислот. Можно пользоваться методом колориметрического титрования, применяя пробирки такого же размера. Стандартный раствор готовят из одной аминокислоты, перенося определенный объем ее в пробирку и нагревая со спиртовым раствором нингидрина. [c.70] Вернуться к основной статье