ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Удерживание вещества на линии старта из "Количественная хроматография на бумаге и в тонком стекле" Буш [1] показал, что, если сильно высушить начальные пятна, некоторая часть растворенного вещества необратимо сорбируется бумагой. Это, очевидно, приводит к ошибкам. Чтобы избежать этого, начальные пятна высушивали всегда в токе холодного воздуха. При этих условиях не наблюдали, в частности, удерживания глюкозы на линии старта. И вполне возможно, что такой прием применим к большинству веществ. Однако встречаются и исключения например, при ТСХ на силикагеле на линии старта удерживается до 7—10% Т-морфина. [c.24] И наконец, перед исследователем встает проблема количественного определения вещества в конечных зонах. При этой операции, естественно, появляются новые возможные источники ошибок. Было решено применить уже полученную информацию к опробованию известных алкалоидов в растениях, используя для определения вещества в конечных зонах денситометрические методы (с учетом применения Хромоскана для денситометрии). [c.25] Выше уже обсуждались условия хроматографического эксперимента, обеспечивающие получение одинаковых конечных зон. При денситометрическом определении содержания вещества в зоне ошибки минимальны при соблюдении следующих условий. [c.26] Бумага. Бумагу следует хранить так, чтобы на нее не попадала пыль — в упакованных пачках кроме того, бумагу нужно в течение ночи привести в равновесие с атмосферой камеры. [c.26] Начальные пятна. Необходимый для нанесения объем раствора следует отмеривать с помощью специального устройства, а полученные пятна, в соответствии с данными Буша [2] и Консдена [18], подсушивать в токе холодного воздуха. [c.26] Развитие окраски. При использовании в качестве реагента для проявления хроматограмм иодплатината калия было найдено, что процесс проявления хроматограмм лучше проводить путем опрыскивания бумаги с обеих сторон, поскольку при проявлении погружением бумаги в раствор реагента на поверхности бумаги сорбировалась пленка, вызывая появление черных пятен. Вполне возможно, что при проявлении хроматограмм другими реагентами можно предпочесть процесс погружения [2, 19]. После опрыскивания хроматограмму высушивали в токе холодного воздуха. [c.27] Одна нз основных проблем в денситометрии заключается в том, чтобы окраска фона, возникающая вследствие избытка проявляющего реагента на бумаге, не маскировала зон определяемых компонентов. В этом смысле весьма полезны светофильтры, однако и при использовании последних фон почти всегда дает сигнал на самописец. Уровень фона зависит от количества проявляющего реагента на хроматограмме. Окраска фона также может изменяться вследствие окисления на воздухе и выцветания. Чтобы избежать этого, денситометрические измерения начинают точно через 1 час после проявления хроматограмм. Если по каким-либо причинам измерения не проводятся, то хроматограммы сохраняют, не проявляя их. Для этих целей хроматограммы хорошо переложить листами фильтровальной бумаги. Хранить хроматограммы следует в темноте и опрыскивать тогда, когда это удобно по условиям денситометрии. [c.27] Из ЭТНХ данных можно видеть, что найденные отклонения весьма близки к отклонениям, полученным ранее при подсчете радиоактивности. Более низкая воспроизводимость данных для кодеина обусловлена, вероятно, дополнительными ошибками, возникающими прп изменении пиков небольшой высоты. [c.28] Средние высоты пиков. Коэффициенты вариации Ь наклон г — коэффициент корреляции. [c.29] Приведенные результаты вновь подтверждают данные, полученные ранее с применением радиоактивных веществ коэффициенты вариации малы, коэффициенты корреляции линир регрессии вполне удовлетворительны, но наклоны этих линий изменяются от листа к листу. [c.29] Приведенные результаты получены на основе рассмотрения нескольких частных хроматографических систем, и вполне очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для подтверждения общего характера отмеченных в настоящей работе закономерностей. Хотя предварительные исследования возможности количественного определения веществ в зонах денсито-метрическим методом были довольно успешными, совершенно ясно, что при этом процессе появляются новые источники отклонений. [c.31] Проблема количественного определения вехцеств в зонах после разделения методом хроматографии на бумаге весьма сложна, а методы, используемые для этих целей, зависят от природы анализируемых веществ. Тем не менее имеются общие положения, которые все-таки могут быть рассмотрены. В настоящей главе обсуждается классический тип хроматограмм на бумаге. В этом случае первоначально бесцветные соединения обнаруживают после хроматографического разделения путем обработки хроматограммы реагентом, образующим с анализируемым веществом хорошо заметное на хроматограмме окрашенное соединение. [c.33] Точность определения сильно зависит от природы анализируемого соединения и особенностей применяемого метода. Это можно показать на примере обычных аминокислот из белкового гидролизата методами одномерной хроматографии на бумаге эти соединения можно определить с точностью до 1—2%, но при использовании специальных методов, как утверждают некоторые исследователи, точность можно повысить до 0,27о- Сахара на хроматограмме можно легко и быстро определить с точностью до 3%. [c.34] Скорость реакции между реагентом и определяемым соединением может быть весьма различной. Когда реакция протекает быстро и вещества успевают полностью прореагировать еще до того, как высохнет хроматограмма, получают, как правило, высокое содержание производного и низкий уровень окраски фона. В некоторых случаях можно ускорить и медленные реакции, выдерживая хроматограммы при повышенных температурах. Этот прием можно почти всегда с успехом использовать в качественном анализе, однако при количественных определениях его следует применять с большой осторожностью. Нагревание часто приводит к заметному увеличению окраски фона. Поэтому, если развитие окраски возможно при комнатной температуре, следует предпочесть именно условия проявления хроматограмм. Поскольку многие производные в какой-то степени чувствительны к свету, хроматограмму после проявления лучше хранить в темноте. Безусловно, весьма важна проблема защиты хроматограммы от воздействия некоторых веществ, которые могут находиться в атмосфере лаборатории. Для этих целей эффективен метод хранения хроматограмм в конверте из полиэтиленовой пленки для изготовления конвертов используется пленка толщиной 0,38 мм. [c.37] При фотографировании следует применять соответствующие светофильтры. Последующий количественный анализ выполняют или путем измерения площади пятен, или денситометрическим методом. При использовании денситометрии существенно, чтобы отпечатки имели достаточно низкую контрастность, или, другими словами, нужно работать в линейной области на кривой зависимости плотности от времени экспозиции, избегая область недодержек и передержек. [c.39] ВО влажной атмосфере также может оказаться эффективным. Важно отметить следующее хотя при высоких концентрациях вещества в зоне реакции этого типа протекают не полностью, при тщательном соблюдении условий проявления хроматограмм они часто исключительно воспроизводимы. [c.41] Третий тип реакции между соединением и реагентом является аномальным, но, к сожалению, именно этот тип реакции обычно встречается при хроматографическом определении лекарственных препаратов. При низком содержании вещества в зоне эти реакции могут протекать полностью, либо возможно недостаточное проникновение проявляющего реагента к веществу, сорбированному на внутренних слоях бумаги, что аналогично взаимодействию по реакции второго типа. Однако при концентрации вещества в зоне выше определенной наблюдается совершенно новое явление интенсивность окраски зоны действительно понижается по мере дальнейшего увеличения концентрации вещества в зоне. Это обусловлено не только тем, что реагент, по-видимому, не проникает к веществу, но и тем, что концентрация вещества в зоне достаточна для изменения характера реакции или даже ее торможения. Все это можно будет увидеть на хроматограмме, где нормальную окраску производного дают лишь зоны с низким содержанием вещества и краевые участки зон с высоким содержанием вещества. Центры зон с высокой концентрацией вещества либо реагируют в незначительной стенени, так что зона еще сохраняет круглую форму, либо их окраска заметно отличается от окраски краевых ее участков. Очевидно, своеобразное поведение веществ этой группы при проявлении хроматограмм значительно ограничивает методы, которые могут быть использованы для количественного определения веществ после разделения их смесей методом хроматографии на бумаге. [c.41] Следует упомянуть и о четвертом способе количественного определения веществ в зонах, осуществляемом путем визуального сравнения интенсивности окраски зон с интенсивностью окраски зон на стандартных хроматограммах. До некоторой степени это приближенный метод, однако при оптимальных условиях, но-видимому, можно добиться точности 25%. Визуальную денситометрию можно использовать в со-метании с методом, основанным на измерении площади зоны. [c.42] ТОЧНОГО для анализа количества веществ требуется многократное нанесение раствора на бумагу. При чрезмерном подсушивании феном бумага может обезвоживаться настолько, что при последующих нанесениях в ту же самую точку или любую другую на линии старта раствор поглощается быстрее и образуются начальные пятна меньшего размера. [c.43] Поэтому можно считать, что денситометры целесообразнее конструировать на основе законов Кубел-ки, а не закона Бера. Однако на практике такой подход не мог бы обеспечить линейной зависимости сигнала от концентрации окрашенного производного, поскольку, по определению Кубелки, бумага не представляет идеальной среды. Она не является ни бесконечно толстой, ни идеально рассеивающей микроскопическое исследование свидетельствует о неровной, интенсивно рассеивающей среде, заполненной промежутками и волокнами последние имеют частично кристаллическую структуру и частично аморфную. Распределение окраски даже в интенсивно окрашенных зонах крайне неравномерное. В этнх условиях конструирование обычных денситометров на основе закона Бера так л е правомерно, как и что-либо другое, и обычно дает удовлетворительные соотношения между величиной сигнала прибора и интенсивностью окраски, даже если они нелинейны. [c.47] Вернуться к основной статье