ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Осаждение белка фенолом из "Практикум по биологической химии" Осаждение белков фенолом с целью их удаления (депротеинизация) получило широкое распространение при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. К числу последних относятся вещества, от которых зависит принадлежность крови человека к той или иной группе (изоантигены системы ABO). [c.67] К 3 каплям раствора белка добавляют избыток фенола (10—15 капель) и встряхивают. Появляется помутнение, указывающее на осаждение белка. Помутнение усиливается при стоянии. [c.67] Нуклеопротеиды играют исключительно важную биологическую роль. Они построены из белка и нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, или полинуклеотид, построена из большого числа мононуклеотидов. Каждый из мононуклеотидов состоит из пуринового или пиримидинового основания, углевода (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. [c.68] Целью этой работы является изучение состава рибо-нуклеопротеида. Для этого нуклеопротеид необходимо разрушить, разделить на составные части и обнаружить их аналитически. [c.68] Дрожжи, являющиеся в данной работе источником рибонуклеопротеида, содержат большое количество свободных углеводов, фосфата и простых белков, поэтому прежде чем изучить состав нуклеопротеидов дрожжей, нужно выделить из них очищенный нуклеопротеид. [c.68] Выделение рибонуклеопротеида (первую часть работы проводит преподаватель, а вторую выполняют студенты). 1. 8 г прессованных дрожжей помещают в химическую пробирку и, проверив, что в лаборатории погашены все горелки и нет включенных электроплиток, добавляют 2—4 мл эфира (приблизительно) для разрушения клеточных оболочек. Содержимое пробирки растирают стеклянной палочкой (или в гомогенизаторе Поттера и Эльве-гейма). Эфир разрушает оболочки дрожжевых клеток, после чего нуклеопротеид можно извлечь раствором едкого натра. [c.69] Если фильтрование идет медленно, в воронку добавляют несколько миллилитров 0,4%-ного (0,1 и.) раствора едкого натра. Отфильтровав 3 — 4 мл экстракта, добавляют к нему двойной объем 3%-ной уксусной кислоты. При этом нуклеопротеид выпадает в осадок. [c.69] Осадок отделяют центрифугированием. Этой операции должно предшествовать тщательное уравновешивание пробирки, которое осуществляется следующим образом. Если центрифуга, используемая в работе, снабжена вынимающимися гильзами,. то берут две гильзы, ставят их на центрифужные весы (рис. И). В одну гильзу помещают пробирку с исследуемым веществом, а в другую — пустую пробирку. Пипеткой наливают в пустую пробирку воду до тех пор, пока не добьются равновесия. Уравновешенные гильзы с пробирками помещают в прямо противоположные гнезда центрифуги, т. е. так, чтобы они находились на одном диаметре. Если центрифуга не имеет вынимающихся гильз, то пробирки уравновешивают без них. Перед пуском центрифуги следует хорошо закрыть крышку во избежание несчастных случаев. [c.70] После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок нуклеопротеида промывают уксусной кислотой. Для этого в пробирку наливают 3%-ную уксусную кислоту до метки 5 мл осадок размешивают стеклянной палочкой и, уравновесив пробирки, отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают. Повторяют промывку описанным способом еще 2—3 раза. [c.70] Гидролиз рибонуклеопротеида. В центрифужную пробирку, содержащую осадок нуклеопротеида, добавляют 10%-ную серную кислоту до метки 4 мл и помещают пробирку на 60 жы в кипящую водяную баню. По истечении указанного срока проверяют, достаточно ли полно прошел гидролиз нуклеопротеида. Для этого в микропробирку отбирают 3 капли гидролизата, добавляют 3 капли 10%-ного раствора едкого натра, 4 капли реактива Фелинга и нагревают пробирку до кипения. Появление желтого осадка указывает на наличие в гидролизате углевода, освободившегося при гидролизе. Если же реакция с жидкостью Фелинга идет не четко, то гидролиз продолжают еще 10—20 мин, после чего вновь проделывают названную реакцию. [c.70] Наличие в гидролизате пептидов доказывают биуретовой реакцией к 3 каплям гидролизата добавляют 1 каплю раствора сернокислой меди и по каплям раствор 10%-ного едкого натра до появления сине-фиолетового окрашивания. [c.71] Кусочек селезенки весом 0,5—1 г растирают в ступке с песком, постепенно добавляя 10—15 1лл 1 М раствора хлористого натрия. [c.71] В химический стакан наливают 30—50 мл воды и сливают в нее надосадочную жидкость, помешивая содержимое стакана деревянной палочкой. ДНП, экстрагированный из селезенки, выпадает в виде тяжей. Его собирают на палочку и переносят в другую пробирку. Препарат сохраняют до следующей работы. [c.72] В работе по исследованию нуклеопротеида дрожжей мы уже ознакомились с обнаружением оснований, углевода и фосфора нуклеиновых кислот. Помимо этих реакций при анализе нуклеиновых кислот в настоящее время широко используются реакции на рибозу и дезоксирибозу. Мы остановимся на одной из них — реакции с дифениламином. [c.72] Раствор дифениламина в смеси уксусной и серной кислотами, дает при нагревании с дезоксирибозой синее окрашивание. При нагревании ДНП гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза реагирует с дифениламином. [c.72] Растворы нуклеиновых кислот бесцветны, они не имеют полос поглощения в видимой части спектра, однако в ультрафиолетовой области они имеют характерный максимум поглощения в области 2600 А. В этой же части спектра находится область 2800 А, ультрафиолетовый свет которой поглощается также белками (их циклическими аминокислотами— тирозином и триптофаном). Изучение поглощения в ультрафиолетовой части спектра проводится с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра ФЭК-Н, снабженного ультрафиолетовым осветителем. [c.72] Дифениламиновая реакция. Берут 2 микрохимические пробирки, в одну из них вносят немного нуклеопротеида дрожжей, а в другую нуклеопротеида селезенки. Добавляют 5—7 капель раствора едкого натра. Встряхивают содержимое пробирки или перемешивают его стеклянной палочкой. Добавляют 10—15 капель дифенилами-нового реактива и оставляют пробирки на 15—20 мин в кипящей водяной бане. Отмечают результат. [c.73] Изучение спектров поглощения (демонстрация). Спектрофотометр подготовляют перед занятием для работы в ультрафиолете согласно приложенной к нему инструкции. Демонстрируют способность растворов нуклеопротеида поглощать ультрафиолетовый свет в области 2600 А. В качестве пустого опыта (ЮО - -ное светопро-пускание) используют раствор, взятый для приготовления нуклеопротеида. [c.73] Вернуться к основной статье