Осаждение белка фенолом

Осаждение белков фенолом и формалином [c.260]

Работа 50. Осаждение белка фенолом [c.67]

Осаждение белков фенолом с целью их удаления (депротеинизация) получило широкое распространение при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. К числу последних относятся вещества, от которых зависит принадлежность крови человека к той или иной группе (изоантигены системы ABO). [c.67]

К 3 каплям раствора белка добавляют избыток фенола (10—15 капель) и встряхивают. Появляется помутнение, указывающее на осаждение белка. Помутнение усиливается при стоянии. [c.67]

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА НАФТОЛАМИ И ФЕНОЛАМИ [c.48]

Химическая денатурация. Свертывание белков происходит при воздействии многих химических реагентов, как-то фенолы (например, карболовая кислота), альдегиды (например, формалин), пикриновая, трихлоруксусна.я, метафосфорная кислоты, танин и другие вещества. Сюда же относится необратимое осаждение белков солями тяжелых металлов (соли Ре, Си, РЬ, Hg). При этом белковые вещества вступают в прочные соединения с ними. Далее, белки типа альбумина, глобулина и казеина переводятся в нерастворимое состояние действием концентрированных сильных минеральных кислот, а также щелочей. [c.376]

Методы выделения групповых веществ крови различаются в зависимости от источника. Так, например, для их выделения из жидкости кисты, ее лиофилизуют и экстрагируют 95%-ным раствором фенола при комнатной температуре большая часть группового вещества крови остается в нерастворимом осадке в достаточно чистом состоянии . При выделении этих гликопротеинов из слизистой желудка приходится предварительно обрабатывать исходный материал пепсином или подвергать его автолизу в течение долгого времени для освобождения от сопутствующих белков. Полученный после осаждения спиртом порошок экстрагируют 90— 95%-ным раствором фенола, в который в данном случае переходит групповое вещество из фенольного раствора гликопротеин осаждают спир-том . [c.581]

Интактную РНК можно отделить от белка путем добавления детергентов и последующего осаждения фракций, при котором бело экстрагируют с помощью фенола или применяя нагревание в присутствии соли. Белок, освобожденный от РНК, легко полимеризуется при низких pH, образуя стержни того же диаметра, что и у нормального вируса, но различной длины. [c.359]

При исследовании отдельно плазмы и эритроцитов по Фолину— Ву для осаждения берется для плазмы 8 объемов Н2О и V2 объема каждого осадителя. В случае, когда не удается сразу чисто осадить белки и мочевую кислоту и приходится дополнительно прибавлять реактивы, цифры получаются ниже, по-видимому, потому, что часть фенолов захватывается осадителями. [c.250]

Для выделения таких биополимеров широко применяется фракцио- нированное осаждение ( апример, спиртом), позволяющее отделить некоторые гликопротеины от белков. Для отделения белков используют также осаждение солями или экстракцию фенолом. Применение различных видов хроматографии (иониты, сефадексы) позволяет получить достаточно чистые препараты углевод-белковых комплексов. [c.74]

Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12 представлены результаты расщепления суммарной ДНК, агробактерий ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой кислоты агробактерий. [c.76]

Свободные аминокислоты анализировали хроматографическихм методом. После предварительного осаждения белков свободные аминокислоты, содержащиеся в фильтрате, собирали на катионите КУ-1. С целью вытеснения аминокислот катионит обрабатывали 5%-ным раствором углекислого аммония. Полученный раствор с аминокислотами выпаривали досуха на водяной бане. Очищали смесь аминокислот 75%-ным этиловым спиртом и далее разгоняли на хроматографической бумаге (Ватман № 2) в восходящем направлении. В качестве растворителей использовали смесь чистого бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4 1 1, фенол, насыщенный фосфатным буфером (pH 12), и воду. Четырехкратный разгон в первом из названных растворителей давал возможность выделить следующие аминокислоты 1) цистин-Ьцистеин, [c.138]

РНК чаще всего получают обработкой препарата фенолом, насыщенным водой, в котором осаждаются все белки. При определенных условиях иногда удается удалить и ДНК. Последовательные стадии осаждения и экстрагирования позволяют отделить РНК от полисахаридов (в водном слое), ДНК (если она имеется) и других компонентов [111 —113]. Нуклеиновые кислоты можно отделить от белков, удаляя последние с помощью протеолнтических ферментов. [c.159]

Источником получения ДНК обычно является ви-лочковая железа (тимус) телят, т. к. в ее клетках ядра составляют больше половины объема. Для получения РНК удобнее всего использовать дрожжи. Н. к. всегда тесно связаны с белками в нуклеопротеидных структурах. Для их освобождения проводят денатурацию белков добавлением к взвеси клеток (предварительно вскрытых путем разрушения их оболочки ) р-ра фенола высокой концентрации, а также нек-рых детергентов (напр., додецилсульфата) или хлороформа. Обычно фенольная депротеинизация ведется так, что фенола дается большой избыток и после отстаивания или центрифугирования образуются два слоя внизу — фенол, насыщенный водой, сверху — вода, насыщенная фенолом. Денатурированные белки сосредоточиваются в нижнем слое и у границы раздела, Н. к.— в верхнем водном слое, откуда их осаждают спиртом. При фенольной экстракции возможно частичное фракционирование Н. к. на ДНК (растворяется преимущественно при pH9) и РНК (растворима и при рН5). Однако полностью отделить ДНК и РНК друг от друга удается только дополнительным воздействием специфическими гидролитич. ферментами ДНК-азой и РНК-азой. Эти ферменты добьхваются из поджелудочной железы рогатого скота, подвергаются тщательной очистке и кристаллизации. Действуя ДНК-азой, разрушают ДНК и получают чистую РНК. С помощью РНК-азы очищают ДНК от РНК. После ферментативной обработки полученные продукты снова подвергают фенольной депротеинизации с последующим осаждением Н. к. спиртом. [c.189]

В современных методиках выделения ДНК (обзоры — см. ) основной стадией является обычно экстракция биологического материала фенолом 9. При этом ДНК после разделения слоев переходит в водный слой или остается в виде осадка в интерфазе, а большая часть белка денатурирует и переходит в фенольный слой. Для удаления белка из препаратов ДНК используют также обработку детергентами смесью хлороформ — изоамиловый (или октиловый) спирт а также инкубацию с протеолитическими ферментами, например с проназой РНК отделяют от ДНК фракционным осаждением спиртом и обработкой препарата рибонуклеа-зами. Большая часть полисахаридов обычно удаляется при фракционном осаждении этанолом или изопропанолом в некоторых случаях приходится применять дополнительную очистку (экстракция метилцеллозольвом, фракционирование цетавлоновых солей, электрофорез). [c.29]

Белки в пробе можно коагулировать, например нагреванием. Липиды, воски, парафины и другие липофильные соединения удается отделить от гидрофильных компонентов методом экстракционного разделения между фазами петролейного эфира и водных спиртов (например, 60- и 95%-ного метанола в зависимости от природы веществ) в одной делительной воронке или в нескольких, применяя метод противоточного распределения. Различные виды аминокислот (основные, кислые и нейтральные) можно предварительно разделить посредством электрофореза на бумаге или в геле. Для отделения различных органических кислот и ряда соединений типа фенолов от сахароподобных веществ пригодны даже такие старые методы, как осаждение ацетатом свинца, основным ацетатом свинца и т. п. Некоторые группы алкалоидов можно высадить из экстрактов с помощью специфических реагентов, а затем выделить их. В тех случаях, когда представляют интерес органические вещества средней полярности, можно иногда очистить пробу непосредственно на бумаге, на которой должен проводиться хроматографический анализ. Неочищенную пробу хроматографируют сначала чистым петролейным эфиром (иногда несколько раз), липиды при этом перемещаются вместе с фронтом растворителя. Далее хроматограмму сущат, после этого можно хроматографировать пробу еще раз чистой водой, если целевое вещество полностью нерастворимо в ней. Вода вымывает из пробы соли, сахара, аминокислоты и т. д., которые перемещаются вместе с фронтом элюента или вблизи него. В заключение пробу хроматографируют специально подобранным элюентом, следя при этом, чтобы фронт растворителя не продвинулся на такое же расстояние, как при предыдущих операциях по очистке. [c.88]

Методы фракционирования включают осаждение нейтральными солями [19—21], электрофорез [22, 23], хроматографию на фосфате кальция [24—26] и осаждение дигидрострептомицином [27]. Недавно для фракционирования рибонуклеиновых кислот была использована фракционная диссоциация комплексов нуклеиновая кислота — гистон, примененная ранее к дезоксинуклеиновым кислотам [28]. Во всех фракциях отношение 6-амино- к 6-кетонуклео-зидам было близко к единице. В некоторой степени фракционирование происходит при экстракции фенолом [29—32], возможно как результат дифференциального связывания нуклеиновых кислот с белками. Анионообменные целлюлозы, такие как ЭКТЕОЛА и ДЭАЭ, широко применяются в настоящее время для фракционирования не только рибонуклеиновых кислот [33, 34], включая специфичные для аминокислот транспортные РНК [35], но и рибонуклео- [c.365]

Так как гидрат окиси цинка и гидрат окиси урана на фенол фталеин щелочной реакции не дают, а уксуснокислый натрий — нейтральная соль, то смесь этих веществ дает щелочную реакцию на фспо лфталеин, только если NaOH прибапяен в избытке. Для полной нейтрализации на 1 молекулу осажденного натрия нужно 8 молекул едкого натрия так как уранил осаждает и белки, то при работе с кровью нужно предварительно их удалить, для чего удобнее всего пользоваться трихлоруксусной кислотой. [c.259]

При температурах выше 68° фенол и вода смешиваются в любых соотношениях [14 J. При охлаждении гомогенная смесь разделяется на два слоя верхнюю водную фазу, насыш енную фенолом, и нижнюю фенольную, насыщенную водой. Так, при 15° вода содержит 8,2% фенола, а в феноле растворено 37,4% воды. Если грамотрицателъные бактерии обрабатывают гомогенной смесью равных объемов фенола и воды при 65—68° [9], клетки быстрее разрушаются и значительная часть (до 40%) бактериальных веществ переходит в раствор. После охлаждения до 5—10° и центрифугирования получаются три фракции водный слой, фенольный слой и нерастворимый ни в воде, ни в феноле остаток (методика В в работе [9]). Водная фаза после диализа содержит бактериальный липополисахарид (О-антиген, эндотоксин [И, 12[), свободный от белка, и нуклеиновую кислоту. Липополисахарид и нуклеиновую кислоту можно разделить различными способами, например осаждением спиртом [9, 15, 16] (см. также стр. 285), ультрацентрифугированием [15], избирательным осаждением нуклеиновых кислот катионными детергентами, например цетилтриметиламмоний бромидом (цетавлон) [17, 17а], или комбинацией этих способов. [c.327]

Распределение белка и полисахарида или липополисахарида между фенолом и водой было применено для расщепления и разделения специфических осадков полисахаридных антигенов с антителами [40]. В принципе осадок диспергируют в воде и прибавляют при перемешивании равный объем жидкого фенола. После разделения фаз центрифугированием водный слой содержит свободный от антител полисахаридный антиген, который можно выделить и проанализировать. Метод позволяет очищать полисахаридные анти1 ены путем избирательного осаждения антителами [32, 40], т. е. фракционировать полисахаридные антигены по их серологической специфичности. Хоман и Лене 41] очистили препараты гепарина, содержащие белки, использовав смесь фенола с водой. Из водной фазы, которая оказалась свободной от белка, был выделен очищенный гепарин. [c.330]

Группоспецифические мукополисахариды крови человека обычно получают экстракцией 90- или 95%-ным фенолом лиофнлизованных биологических жидкостей, таких, как слюна, желудочный сок, жидкость кисты яичника, меконий, а также тканей, обработанных протеолитиче-скими ферментами. Большинство активных веществ нерастворимо в этом растворителе. Если же они оказываются растворимыми, как, например, вещества, выделенные из тканей, обработанных пепсином при pH 1—2, то их легко можно осадить прибавлением небольших количеств спирта. Мукополисахариды, полученные этим путем, в основном свободны от песпецифических белков и жиров, содержащихся в нативных выделениях и экстрактах тканей, и представляют собой материал, который после дальнейшей очистки фракционным осаждением из водных растворов подходящим органическим растворителем наиболее часто употребляется для химических и серологических исследований (см. Кабат [1] и Морган [2]). [c.336]

Допустим, что перед исследователем стоит задача определить природу дефекта у мутантной мыщи, синтезирующей аномально низкое количество альбумина (белка, который в норме секретируется в кровь клетками печени в значительных количествах). Для этого прежде всего необходимо взять образцы ткани печени у дефектных и нормальных мыщей (последние служат в качестве контролей) и обработать клетки сильным детергентом для инактивации клеточных нуклеаз, которые в противном случае могут разрушить нуклеиновые кислоты. Затем отделяют РНК и ДНК от всех других компонентов клетки присутствующие белки при этом полностью денатурируются, их удаляют последовательной экстракпией фенолом - мощным органическим растворителем. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе. Чтобы их отделить от низкомолекулярных клеточных соединений, проводят осаждение спиртом. После этого ДНК отделяют от РНК, пользуясь их различной растворимостью в спиртах и обрабатывают высокоспецифическими ферментами (соответственно РНКазой или ДНКазой), чтобы освободиться от нежелательных примесей нуклеиновых кислот. [c.239]

Для обнаружения белков с давних пор применяют несколько проб, основанных главным образом на осаждении. Малые количества нативных белков можно обнаружить, применяя чувствительную микрореакцию, предложенную Файглем и Ангером [8], в которой появляется синяя окраска водорастворимых щелочных солей этилового эфира тетрабромфенолфталеина, окрашенного в желтый цвет. При действии разбавленной уксусной-кислоты эти соли превращаются в соответствующий фенол. При взаимодействии этого эфира с белками, находящимися обычно в коллоидном состоянии, появляется синее окрашивание (вероятно, образуется солеобразное соединение), устойчивое к действию уксусной кислоты. Появление такой же окраски наблюдается и при взаимодействии белков с другими индикаторами, что мешает анализу. [c.258]

Обработка фенолом, применявшаяся для выделения вирусных РНК, вызывает денатурацию вирусного белка. В большинстве случаев эта денатурация, вероятно, необратима. Одиако Андерер [20, 21] нашел, что денатурированный белок ВТМ может быть выделен из фенольной фазы осаждением метанолом и ренатурирован нагреванием до 60 °С при pH 7,0—7,5. О рена-турации белка ВТМ свидетельствовали его растворимость в нейтральной водной среде, серологическая aiiTHBHO Tb, а также способность образовывать вирусоподобные палочки при реполимеризации, а при инкубации с РНК ВТМ — инфекционные вирусные частицы. [c.75]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология