ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение активности холинэстеразы из "Химия травляющих веществ Том 2" Можно определять активность АХЭ или ХЭ. Для определения активности АХЭ в большинстве случаев подвергают гемолизу эритроциты ХЭ определяют в сыворотке крови. При использовании цельной крови можно путем выбора специфического субстрата (ацетил-р-метилхолина для АХЭ и бутирилхолина для ХЭ) или применяя определенные концентрации субстрата достигнуть дифференцирования ферментов. Последний из указанных способов основан на уже описанном ингибировании АХЭ более высокими концентрациями субстрата. Так, при концентрации ацетилхолина 10 М определяется преимущественно АХЭ, при концентрации же 10 М — ХЭ, однако в каждом случае в определенной степени (примерно на /б) проявляет активность и другой фермент. Определение активности осуществляют либо по установлению скорости ферментативного расщепления субстрата (кинетический метод) или путем определения конечных продуктов и не вступившего в реакцию субстрата. [c.165] В зависимости от метода активность фермента определяют по разным критериям. В классическом манометрическом способе мерой активности фермента является количество выделяющейся двуокиси углерода. [c.165] Аммон ввел холинэстеразную единицу, которая обозначает количество фермента, требующееся для расщепления 10 Л1 ацетилхолина в течение 1 ч при 37 °С и pH 7,4. Такое же количество ацетилхолина требуется для выделения 10 М двуокиси углерода (22,4 мм ). [c.166] В электрометрическом методе активность холинэстеразы определяют по снижению pH через 60 мин после начала реакции При этом нормальным значением активности фермента считается изменение ЛрН в течение 1 ч от 0,70 до 1,05 при работе с 0,2 мл сыворотки при 25 °С. [c.166] Для определения активности холинэстеразы разработано много способов. Надежные результаты дают методы, основанные на определении количества образующегося продукта, в которых соблюдается линейная зависимость между активностью фермента и количеством образующегося продукта. Несмотря на то, что манометрический метод довольно сложен в выполнении, он в этом отношении (соблюдение линейной зависимости) еще не превзойден. Более простыми являются потенциометрические методы, которые дают весьма точные результаты, особенно при использовании автотитратора, автот матически поддерживающего постоянный pH, вследствие чего исключается влияние pH на активность фермента. Ниже приведен (см. также табл. 10) обзор различных способов определения активности фермента. Подробно описаны манометрический и потенциометрический способы как наиболее пригодные. [c.166] Титриметрические методы. Выделяющуюся кислоту титруют в присутствии соответствующего индикатора (бромтимоловый синий, феноловый красный) или проводят в рН-метре потенциометрическое титрование едким натром 8.28.32 интервалами в 5 мин в течение 1 ч до достижения неизменяющегося pH. [c.167] Электрометрические методы измерение АрН) - В этих методах изменение pH, вызываемое выделяющейся кислотой, измеряется по истечении определенного времени рН-метром. При этом используется специально разработанный Михелем буфер с исходным pH 8,0, буферные свойства которого обеспечивают линейную зависимость между активностью фермента и изменением pH. Другим преимуществом метода является возможность параллельно проводить измерения в нескольких пробах По полученным значениям АрН можно определить число микромолей разложившегося ацетилхолина. Для этого прибавляют стандартный раствор кислоты к смеси буфер — фермент и измеряют уменьшение значения pH при определенных количествах кислоты. Используя эти величины, строят калибровочную кривую, по которой устанавливают количество разложившегося субстрата. [c.168] Колориметрические методы с рН-индикатором. Пробу, содержащую фермент, смешивают с субстратом и соответствующим индикатором и определяют время, в течение которого окраска пробы становится одинаковой с окраской эталона. Значение pH, устанавливаемое прибавлением соответствующих количеств стандартного раствора кислоты, целесообразно выбирать в границах наиболее заметного изменения окраски индикатора, например, в случае бромтимолового синего при pH 7—7,2. Другими удобными индикаторами являются феноловый красный и ж-нитрофенол Окраски сравнивают визуально либо фотометрически и отмечают время выравнивания окрасок пробы и эталона. [c.168] Рекомендуется использовать индикаторные бумаги, выпускаемые под торговым названием ахолест и биофан С при изготовлении которых в качестве субстрата выбран ацетилхолин, а в качестве индикатора — бромтимоловый синий. [c.168] Электрохимические методы определения тиохолина 2-б5 Современный электролитический способ основан на деполяризации платинового анода тиохолином, на котором он окисляется в дисульфид. Определение проводят в тройной буферной смеси (pH 1,А с концентрацией субстрата (иодистых бутирилтиохолина для ХЭ и ацетилтиохолина для АХЭ) 2 10 Л1. [c.169] Определение тиохолина, образующегося при распаде субстрата, можно также осуществить амперометрическим титрованием в присутствии соединений ртути Резкое возрастание силы тока свидетельствует о конце титрования, т. е. об избытке HзHgI в реакционной среде. [c.170] Флуоресценция нафтола, образующегося при расщеплении а-и р-нафтилацетатов, использована в очень чувствительном методе определения активности фермента При гистохимических исследованиях эстераз нафтол обнаруживают в виде окрашенных соединений, получаемых в результате различных реакций сочетания например с а-нафтилдиазо-1,5-нафталиндисульфокислотой или диазотированным розанилином . [c.171] Содержание образующегося окрашенного в синий цвет индофенола определяют фотометрически при 625 нм. ifo o6 дает точные и воспроизводимые результаты в пределах 25—150 холинэсте-разных единиц Аммона. [c.171] Другими хромогенными субстратами являются различные сложные эфиры п- или о-нитрофенола - 5 и фенилбензоат . Образующийся фенол определяют цветной реакцией Фолина и Циокалтё, а 2-карбонафтоксихолин — по окраске азокрасителя, получающегося после гидролитического расщепления и сочетания с диазотированным о-дианизидином. [c.171] Вернуться к основной статье