ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез на бумаге из "Практическая биохимия" Большую роль в изучении белков сыворотки крови сыграл метод электрофореза, требующий сложной и дорогой аппаратуры. Доступность этого метода очень увеличилась с развитие.м его видоизменения — электрофореза на бумаге. Для последнего предложено много приборов, отличающихся между собой довольно значительно, однако принцип метода везде один и тот же. Мы приводим здесь этот метод так, как он описан А. Е. Гур-вичем 2. [c.111] В основе электрофоретического метода лежит различие величины заряда разных белков сыворотки. Поэтому, если нанести каплю сыворотки на полоску фильтровальной бумаги, смоченной буферным растворо.м, и пропускать через эту полоску электрический ток, то отдельные белки будут передвигаться в электрическом поле с различной скоростью. Сыворотка крови представляет собой сложную смесь, из которой до настоящего времени удалось различными методами выделить более четырех десятков индивидуальных белков. При помощи электрофореза на бумаге эту сложную смесь можно разделить на 5 основных групп альбумины, а-ь аг-, р- и -глобулины. При ряде заболеваний наблюдается изменение соотношений между этими фракциями, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. [c.111] Камера для электрофореза на бумаге. [c.112] Наносить сыворотку нужно на влажную бумагу, поэтому иногда последнюю предварительно смачивают буферным раствором, однако лучше, поместив полоску в прибор, дать ей возможность постепенно пропитаться буферным раствором. [c.113] Наиболее контрастное разделение сыворотки получают при использовании веронал-мединалового или фосфатных буферных растворов с рН-8,6 и ионной силой 0,1 — 0,05. [c.113] Для приготовления веронал-мединалового буферного раствора 10,32 г мединала (натриевой соли веронала) растворяют в 300 мл дистиллированной воды, добавляют 1,84 г веронала и нагревают смесь на водяной бане до растворения веронала. Затем объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой. [c.113] Нанесение сыворотки. На бумажную полоску обычно наносят 0,02, 0,01 или 0,005 мл цельной сыворотки. Необходимое количество сыворотки отмеряют при помощи микропипетки е.м-костью 0,1 мл от прибора Сали или специальной автоматической пипетки. Лучше всего наносить сыворотку на середину бумажной полоски не в виде капли, а в виде поперечной полоски при помощи шлифованного предметного стекла (ширина 1,5 см). Для этого изучаемую пробу размазывают по краю стекла, а затем, повернув стекло каплей вниз, прикладывают его под острым углом к поверхности бумаги и придерживают в этом положении несколько секунд, пока сыворотка не впитается в бумагу. [c.113] После нанесения пробы прибор закрывают крышкой, на нижнюю поверхность которой прикрепляют лист фильтровальной бумаги, чтобы конденсирующаяся на крышке жидкость не попадала на электрофореграммы. [c.113] Проведение электрофореза. Электрофоретическое разделение сыворотки на бумаге проводится обычно в течение 6—24 часов при градиенте потенциала от 3 до 8 вольт на 1 см пути тока. Следовательно, при длине бумажных полос в 40 см можно применять источники тока (постоянного) с напряжением от 110 до 320 вольт. Лучше всего пользоваться ламповым выпрямителем, позволяющим регулировать напряжение от 50 до 450 вольт. Чтобы следить за напряжением и силой тока во время опыта, в цепь необходимо включить вольтметр и миллиамперметр. В описываемых условиях хорошее разделение получается при электрофорезе сыворотки в течение 18 часов при 240 вольтах. [c.113] Значение температуры. Лучше всего проводить электрофорез на холоду (3—10°). Но хорошие результаты можно получить и при комнатной температуре (даже при 25°). [c.114] Электрофореграмму погружают на 5 минут в ванночку с красителем, после чего не связавшуюся с белком краску удаляют прополаскиванием электрофореграммы в 2%-ном растворе уксусной кислоты. Отмывание следует производить до тех пор, пока фон не станет совершенно белым, а уксусная кислота не перестанет окрашиваться в желтый цвет. [c.114] Имеется указание что выгоднее готовить раствор бромфенолового синего на растворе 10%-ной трихлоруксуоной кислоты (0,2 г бромфенолового синего в 100 мл 10%-ной трихлоруксус-ной кислоты). Окрашивание производится в течение 10—15 минут, затем бумажную полосу промывают водой до синего окрашивания, которое показывает, что трихлоруксусная кислота удалена вся. Полосу немедленно высушивают при 105° в течение 15—20 минут. [c.114] Состав краски насыщенный раствор краски в метаноле, содержащем 10% уксусной кислоты. [c.114] Окрашивание продолжается 10 минут, после чего электрофореграмму промывают метиловым спиртом, содержащим 10% уксусной кислоты. [c.114] Состав краски метанола—100 мл, уксусной кислоты — 10 мл, воды — 90 мл, краски — до насыщения. [c.114] Окрашивание продолжается 15 минут, затем электрофореграммы на 15 минут помещают для фиксации в метанол. Отмывание производят разбавленным в 3 раза метанолом, содержащим 1 % уксусной кислоты. [c.114] При отсутствии планиметра нарисованную на миллиметровой бумаге электрофореграмму вырезают ножницами и взвешивают. Затем ее разрезают между пиками и взвешивают каждый пик отдельно. Общий вес электрофореграммы принимают за 100 и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет вес каждого пика. [c.116] Вернуться к основной статье