ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы определения белка из "Белки Том 1" Очевидно, что выбор того или иного метода зависит от той цели, с которой его применяют. Например, в процессе фракционирования или при определении специфической активности еще не полностью очищенного вещества весьма удовлетворительным может быть быстро осуществляемый метод анализа, обладающий умеренной точностью и воспроизводимостью. В то же время при исследовании свойств конечного продукта выделения необходимо применять метод, обладающий максимально возможной точностью определения. Кирк [59] опубликовал критический и хорошо составленный обзор большинства методов определения белка. [c.16] Многие из описываемых ниже методов основаны на определении какой-либо составной части белковой молекулы или на таком свойстве этой молекулы, которое зависит от содержания в ней одного или нескольких компонентов. Если указанные методы применяются для определения белков неизвестного состава или для наблюдения за ходом фракционирования смесей, состоящих из весьма различных по своим свойствам белков, то получаемые результаты нельзя считать вполне точными, если при этом неизвестны состав или свойства исследуемых веществ. [c.16] Метод Кьельдаля иногда обесценивается еще и тем, что при его применении не соблюдают некоторых из мер предосторожности, необходимых для получения точных результатов. В последнее время рядом исследователей [61—63] были пересмотрены условия, необходимые для того, чтобы весь азот при разложении любого белка полностью превращался в аммиак. Имеется ряд удовлетворительных методов измерения количества аммиака, образовавшегося при разложении. При надлежащем внимании к технике аналитического определения эти методы не содержат источника значительной ошибки (см. статью III). [c.17] Удельный вес. Удельный вес раствора можно определять с помощью пикнометра, методом падающей капли [77] или одним из нескольких флотационных методов [76—82]. Так как парциальный удельный объем белков изменяется от 0,68 до 0,77, то соответственно может изменяться суммарная ошибка определения, если неизвестна зависимость между концентрацией белка и удельным весом раствора. Однако этот метод, требующий очень малых количеств вещества, можно сделать исключительно чувствительным. [c.20] Показатель преломления. Показатель преломления раствора также можно использовать для определения концентрации белка. В литературе опубликованы значения инкремента удельной рефракции для ряда очищенных белков [83 — 88]. Показатель преломления обладает значительным температурным коэффициентом, который следует учитывать, сравнивая результаты измерений, проведенных при комнатной температуре, с результатами оптических измерений (например, с данными электрофореза), проведенных при температуре около 0° [82]. Во многих случаях для определения концентрации белка удовлетворительным является рефрактометр погружения с чувствительностью 3 10 5, но для целей, требующих более высокой точности, можно применять описанный Спейсером и Брайсом [89] дифференциальный рефрактометр с чувствительностью 3 10 6 [87, 88]. [c.20] Следует отметить, что как определение удельного iBe a, так я измерение показателя преломления оказались пригодными для определения концентраций этилового спирта и других растворителей, а также солей, например сернокислого аммония, в реагентах или в белковых растворах. В последнем случае необходимо вводить поправку на влияние белка [90]. [c.20] Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20] В литературе имеются сведения о коэффициентах экстинкции ряда очищенных белков [85, 95—99]. Необходимо всегда указывать условия проведения измерений, особенно ширину полосы поглощения, которая несколько влияет на значение коэффициента эк-е-тинкции. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, также незначительно изменяется от белка к белку. [c.21] Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды поглощают ультрафиолетовое излучение гораздо сильнее, чем белки [100]. Несмотря а то что максимуму поглощения в этом случае соответствует длина волны 260 тр, поглощение при 280 т,и является все еще достаточно сильным для того, чтобы присутствие даже небольших количеств нуклеиновой кислоты серьезно мешало определению белка. Отношение интенсивности поглощения при длинах волн 280 и 260 пу (о 28о/б 2бо) можно использовать в качестве меры отношения количества нуклеиновой кислоты к количеству белка, так как для многих белков это отношение велико (около 1,75), а для нуклеиновой кислоты мало (0,5). Таким образом, можно получить долю, вносимую нуклеиновой кислотой в суммарную величину поглощения при 280 пц, и найти величину поглощения, соответствующую чистому белку [101]. [c.21] Вернуться к основной статье