ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Потери ДНК при выделении методом органической экстракции из "Подготовка биологического материала лдя молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел" В связи с тем, что в ядрах ДНК находится не в свободном состоянии, а в составе хроматина, выделение ДНК в чистом виде — довольно непростая задача. В настоящее время наиболее надежным методом получения препаратов ДНК является фенольно-детергентный метод, одним из существенных недостатков которого, однако, является значительная потеря ДНК на разных этапах экстракции. [c.75] Верхнюю фазу отбирают и повторяют с ней описанную процедуру еще несколько раз. Но при этом каждый раз теряется определенная доля ДНК — из-за того, что очень трудно собрать всю водную фазу целиком. [c.76] В практике работы отделения молекулярногенетических исследований 124 Центральной Лаборатории Медико-Криминалистической Идентификации Министерства Обороны Российской Федерации часто приходится работать с биологическим материалом, содержащим небольшие количества ДНК, что определяет важность прогноза возможных потерь препарата ДНК в процессе ее экстракции. [c.76] Ядерная ДНК клеток животных соединена с основными белками — гистонами, образуя так называемый хроматин. Этот комплекс содержит ДНК и гистоны в приблизительно равных количествах. Здесь, также помимо гистонов, присутствуют и разнообразные кислые белки, так что отношение всех белков к ДНК (по массе) в хроматине составляет приблизительно величину, равную 1,7. Эту величину мы используем в следующем примере. [c.76] Необходимо рассчитать требуемое количество депротеинизаций (п). [c.77] То есть, необходимы три депротеинизации. [c.78] С учетом же других этапов очистки ДНК, эти потери становятся еще в 1,5-2 раза больше. [c.78] Эксперту также полезно уметь оценивать и количество ткани, требуемое для выделения определенного количества ДНК. [c.78] Для выполнения дальнейших расчетов, необходимо рассчитать массу ДНК, содержащейся в одной соматической клетке человека. [c.78] Рассчитаем сколько необходимо взять для анализа компактного вещества костной ткани, чтобы получить 1 мкг ДНК. [c.79] Допустим, выход чистой ДНК при выделении равен ц = 33% от исходного количества ДНК в остеоцитах, содержание остеоцитов в компактном веществе костной ткани — С = 20000-26000 кл/мм . Сер = 23000 кл/мм , относительная плотность костной ткани ротп = 1.99 г/см = 1,99 мг/мм . [c.79] Таким образом, для того, чтобы получить 1 мкг ДНК необходимо взять 12 мг компактного вещества костной ткани. В данном расчете, однако, не были еще учтены потери ДНК при различных воздействиях на биологический материал (например, гниение, термическая деструкция и др.). [c.80] Рассчитаем сколько микролитров крови надо взять, чтобы получить 1 мкг ДНК. [c.80] Выход чистой ДНК при выделении равен = 33% от исходного количества ДНК в лейкоцитах, содержание лейкоцитов в крови Сд = 8000 кл/мм . [c.80] Таким образом, для того, чтобы получить 1 мкг ДНК, необходимо взять 66 мкл крови. [c.80] Вернуться к основной статье