ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Зональный электрофорез в градиенте плотности из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Одним из путей стабилизации зон при электрофорезе и изо-электрическом фокусировании, как и при ультрацентрифугировании, служит применение колонок с градиентом плотности. Этот прием может быть использован как для аналитических, так и для препаративных целей. Среда в данном случае не является ограничивающим фактором в отношении размеров разделяемых молекул, а их последующее выделение относительно проще, чем при работе с другими поддерживающими средами. [c.26] Первые результаты, полученные в этой области, детально рассмотрены в ряде обзоров [703, 1189, 1259]. [c.26] При использовании градиента плотности для стабилизации зон против конвекция общие условия, необходимые для создания стабильности, можно сформулировать следующим образом плотность раствора в колонке на всем ее протяжении и в любой момент должна возрастать сверху вниз или градиент по всей длине колонки и в любой момент должен быть положительным [1259]. Условия получения градиентов плотности, удовлетворяющих требованиям проведения зонального электрофореза, были подробно исследованы Свенссоном и др. [1265]. [c.26] Наиболее часто для формирования градиентов плотности используется сахароза, по своим свойствам соответствующая указанным выще требованиям. Кроме того, она дешева и ее раствор обладает определенной вязкостью, способствующей стабилизации зон в то же время эта вязкость не настолько высока, чтобы препятствовать движению заряженных молекул и частиц. Для этой же цели можно применять и другие вещества, например глицерин, этиленгликоль, тяжелую воду и в ограниченном диапазоне концентраций этанол. [c.27] Важное значение имеет также плотность исследуемого раствора. Она должна быть равной или по крайней мере близкой к плотности ореды в месте его введения. В связи с тем что измерение плотностей жидкостей в малых объемах является трудоемкой процедурой, для создания условий, при которых исследуемый раствор и среда будут иметь одинаковую плотность,, применяются более простые методы. Свенссон и др. [1265] предложили в месте введения пробы создавать уступ плотности — крутой локальный градиент плотности. В этом случае достигается хорошее приближение к идеальной плотности пробы, так как она может быть любой в пределах плотностей верхнего и нижнего краев уступа . Обычно формирование слоя исследуемой пробы проходит успешно, если градиент плотности в месте ее внесения настолько крут, что расстояние между этим местом и слоем, имеющим одинаковую с пробой плотность, не превышает нескольких миллиметров. В этом случае раствор пробы почти лэминарно перемещается вверх или вниз до уровня равной с ним плотности и образует тонкую горизонтальную полосу. Если же градиент плотности слишком пологий и (или) расстояние между местом внесения пробы и слоем с равной плотностью велико, то перемещение пробы вплоть до достижения ею этого слоя будет сопровождаться конвекционными токами, ухудшающими качество стартовой зоны. Поскольку при электрофорезе в градиенте плотности в отличие от изоэлектрического фокусирования толщина стартовой зоны существенно влияет на качество разделения, правильное внесение пробы имеет исключительно важное значение. [c.27] МОГ осуществиться, рекомендуется после внесения пробы включать напряжение не сразу, а спустя определенное время, которое зависит от толщины слоя внесенной пробы. Если она составляет 5 мм, то достаточно подождать 15 мин [1259]. [c.28] Необходимо отметить, что гравитационная стабильность золы в момент ее внесения еще не означает, что она будет сохраняться н дальше. Часто слой исследуемой пробы (несмотря на то что ее плотность была тщательно подогнана) обнаруживает тенденцию к образованию мелких капелек, которые оседают все глубже и глубже в колонку и могут полностью разрушить стартовую зону. Причина этого явления заключается в возник- овении отрицательного градиента плотности из-за того, что сахароза диффундирует в начальную зону быстрее, чем из нее диффундируют белки [162]. [c.28] Свенссон и др. [1265] предложили для преодоления этой трудности дополнительно растворять в пробе вспомогательные вещества (декстран, глицерин, иодистый калий), которые будут диффундировать из нее быстрее, чем белки, и таким образом противодействовать обратной диффузии сахарозы. [c.28] Создание крутого градиента плотности ниже слоя разделяемых макромолекул также препятствует образованию капелек. [c.28] В принципе исследуемый раствор можно внести в любом месте в пределах градиента плотности. Однако если заряды разделяемых белков имеют один и тот же знак, то их омесь лучше помещать в самой нижней или самой верхней части градиентной колонки. Есл И же в пробе присутствуют как положительно, так и отрицательно заряженные компоненты, то образец лучше расположить где-нибудь в середине колонки. [c.28] Обычно применяют линейные градиенты плотности, однако в некоторых случаях в верхней части колонки целесообразно создавать также и более крутые нелинейные градиенты. Практически можно воспользоваться любым методом, предложенным для получения градиентов плотности. Наиболее простая методика, не требующая никаких специальных приборов, заключается в последовательном наслаивании нескольких растворов в порядке убывашя их плотности. Неоднородности на границах примыкающих зон позднее сглаживаются благодаря диффузии. Однако в настоящее время больщинство исследователей работают с градиентными смесителями разных типов, используемыми для создания градиентов концентрации растворов при хроматографии, центрифугировании в градиенте плотности или изо-электрическом фокусировании. Некоторые виды этих устройств и математические формулы для расчета формы кривой градиента плотности описаны Свенссоном [1259]. Приборы нескольких типов, позволяющие по желанию легко получать градиент плотности нужной формы, выпускаются промышленностью. [c.29] Для проведения зонального электрофореза в градиенте плотности были разработаны приборы разных типов. Сведения о приборах, предложенных в начальном периоде применения этого метода, содержатся в обзорах Колина [703] и Свенссона [1259]. Ниже будут описаны лишь екоторые другие типы приборов. [c.29] Специальный прибор для электрофореза в градиенте плотности был сконструирован Свенссоном и др. [1259, 1264, 1265]. Электрофорез проводится в вертикальной стеклянной колонке, снабженной охлаждающей рубашкой для достижения хорошего термостатирования. Платииовые электроды помещают в боковые трубки, одна из которых при помощи жидкостного контакта соединяется с нижней, а другая — с верхней частью разделительной колонки. Применение отдельных электродных сосудов позволяет удалять пузырьки газа, не нарушая градиента плотности. Фракционирование градиента после проведения разделения осуществляется через капиллярную трубку, введенную в нижнюю часть колонки. Для заполнения колонки градиентом и для внесения исследуемого образца используется дополнительный сосуд, работающий по принципу Мариотта. Описанное устройство было слегка модифицировано Чарлвудом и Гордоном [222]. [c.29] По окончании разделения поршень при помощи стеклянного стержня вдавливают внутрь колонки ступенями по 0,5 или 1 см и собирают фракции раствора, вытекающие через пластмассо вый шланг. [c.31] Этот прибор относ ительио прост, дает воспроизводимые результаты и может быть использован также для изоэлектр иче-ского фокусирования в градиенте плотности. [c.32] Существует и другое гариопособленне с поршневой системой для заполнения и освобождения колонки [870]. Но несмотря на наличие общих черт, его конструкция существенно отличается от описанной выше [985]. [c.32] Вернуться к основной статье