ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Прибор для аналитического диск-электрофореза состоит в основном из верхнего и нижнего сосудов, в которые помещают электроды, изготовленные из платиновой проволоки (или иног да из угольных стержней). Трубки, содержащие столбики геля. [c.93] К дополнительному оборудованию, необходимому для приготовления и последующей обработки гелей, относятся микропипетки, шприцы, подставки, в которые устанавливают трубки для их заполнения, и лампа для полимеризации геля. Для проведения электрофореза нужны источник питания, соединительные провода и вольтметр. [c.94] Аналитический диск-электрофорез в трубках проводят по существу так, как его описал Дэвис [281]. Обычно применяют стеклянные трубки, но некоторые авторы предпочитают трубки из плексигласа или поликарбоната. Внутренний диаметр трубок равен около 5 мм, а наружный 7 мм длина трубки составляет 65—70 мм. Внутренний диаметр должен быть постоянным по всей длине трубки, а ее края — идеально гладкими, так как иначе гель может быть поврежден при его извлечении из трубки. Острые края рекомендуется отшлифовать при помощи точила или наждачной бумаги. Ни в коем случае их нельзя оплавлять на стеклодувной горелке. Если разделяемые вещества характеризуются весьма близкими электрофоретическими подвижностями, целесообразно использовать более длинные трубки [962, 963] однако следует шомнить, что при этом увеличивается время разделения, а следовательно, получаются размытые зоны, которые трудно оценивать количественно. [c.94] Стеклянные трубки перед употреблением тщательно очищают, помещая их на несколько часов в хромовую смесь. Затем их отмывают водой ] высушивают, после чего окунают в ацетон и вновь высуипшают в токе воздуха или в сушильном Н1кафу. [c.94] Для того чтобы предотвратить диффузию компонентов пробы вверх и тепловую конвекцию, было предложено [912] помещать над пробой еще один слой геля. Рекомендуется исследуемые вещества растворять в том же буфере, на котором приготовлен концентрирующий гель. Если образец сильно разведен, то для концентрирования белков путем изотахофореза [281] или методом скачка напряжения [570] требуется более толстый слой концентрирующего геля. В случае высокого исходного содержания солей в анализируемом препарате следует либо удалить их с помощью диализа, гель-фильтрации или каким-то другим способом, либо, если позволяет концентрация макромолекул, развести пробу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы во всех опытах наносимый раствор имел совершенно одинаковые ионную силу, pH и объем. [c.98] Свойства разделяющего геля. Разделяющий гель обычно полимеризуют в присутствии персульфата. Дзвис [281] показал, что при одной и той же концентрации акриламида замена персульфата на рибофлавин приводит к увеличению размера пор в геле. Эти данные были подтверждены в подробном ис-следо вании, проведенном позднее [310]. [c.98] Скорость полимеризации акриламида можно повысить, увеличив концентрацию персульфата, одиако при этом будет уменьшаться длина полимерных цепей [680]. [c.98] Нидлс [907, 908] показал, что белки, аминокислоты и ионы буферных растворов существенно влияют на полимеризацию акриламида. Так, трис и глицинат достаточно эффективно катализируют полимеризацию в отсутствие ТЕМЭД, а белки, наоборот, снижают скорость образования геля, что можно компенсировать повышением содержания ТЕМЭД. [c.99] При работе с высокими концентрациями акриламида (20% и выше) полимеризация геля часто происходит неравномерно из-за чрезвычайно энергичного выделения тепла [339]. Во избежание этого желательно уменьшить скорость реакции, что осуществляют, либо добавляя в гель феррицианид калия, либо просто исключая из него ТЕМЭД, Для предотвращения набухания поверхности геля рекомендуется [339] повысить концентрацию бис-акриламида и наслоить поверх раствора геля не воду, а изобутанол, который, однако, после завершения полимеризации нужно немедленно удалить, чтобы не вызвать дегидратации геля. Как уже отмечалось выше, скорость и качество полимеризации сильно зависят от условий протекания реакции (буферная система, pH, ионная сила, концент рации катализаторов и инициатора). Поэтому для получения воспроизводимых результатов эти условия необходимо стандартизовать. [c.99] После того как гель сформировался, резиновые колпачки или другие приспособления, закрывающие дно трубок, осторожно удаляют, а трубки вставляют в аппарат для электрофореза с помощью резиновых уплотнителей, резиновых пробок с отверстиями или нейлоновых прокладок. При этом концы трубок должны выступать из уплотнителей вверх примерно на 5 мм. Затем в электродные сосуды наливают охлажденный до 4°С буфер. Для удаления образующихся на концах трубок пузырьков воздуха используют пипетку с загнутым носиком или осторожно наклоняют трубки. Однако в последнем случае незапо-лимеризованные пробы могут сместиться или совсем вылиться. [c.99] Для наблюдения за движением электрофоретического фронта в анионной буферной системе к 500 мл верхнего электродного буфера добавляют 2 мл 0,001 %-ного отфильтрованного раствора бромфенолового синего [416] или насыщенного раствора флуоресцеина. В катионной системе к 500 мл верхнего буфера добавляют 1 мл 0,0057о-ного метилового зеленого, метиленового синего или пиронина V [839]. Небольшие количества этих красителей можно вносить также и в отдельные пробы. [c.99] После завершения электрофореза буферные растворы из верхнего и нижнего электродных сосудов сливают вместе, чтобы их можно было использовать повторно. Однако если преэлектрофорез не проводился, то анодный буфер, в котором будет присутствовать персульфат, следует вылить. Для того чтобы избежать сдвигов pH при длительном проведении электрофореза, особенно если применяются разбавленные буферы низкой ем кости, рекомендуется обеспечить циркуляцию буферного раствора. [c.100] Даже если все процедуры тщательно выполняются при стандартных условиях, образование геля может проходить по-разному в отдельных трубках из-за незначительных различий в их диаметрах, местных нарушений в процессе полимеризации, неравномерного выделения тепла и т. д. Поэтому сравнение двух белков путем электрофореза предпочтительно проводить в одном и том же геле при помощи так называемого метода расщепленного геля , впервые разработанного Кларком [236]. Прямоугольный шаблон плотно вставляют в трубку и осторожно вдавливают в разделяющий гель на глубину около I мм. В каждую половинку геля вносят пробу. Чтобы свести к минимуму перекрывание проб, шаблон не следует вынимать из геля до тех пор, пока видимая полоска, образующаяся при перемещении пробы в электрическом поле, не проникнет в гель примерно на I мм. [c.100] Если изучаемые белки имеют заряды разных з наков, то при использовании описанного Выше прибора для диск-электрофореза часть макромолекул во время опыта будет потеряна. Для предотвращения таких потерь и выявления белков, движущихся вверх, Клар к [236] рекомендовал помещать над исследуемой. пробой еще один разделяющий гель высотой 2 см. Позднее Ра кусен [1047] модифицировал этот метод, соединив при помощи пластмассовой вставки две трубки, в каждой из которых находился разделяющий гель в желаемом буфере. В пространство между трубками вводили 1 мл раствора концентрирующего геля, содержавшего пробу, и подвергали его фотополимеризации. [c.101] При исследовании рибосомных белков методом двухстороннего электрофореза [654] авторы помещали пробу между двумя разделяющими гелями. Столбик геля приготавливали в следующей последовательности разделяющий гель -- концентрирующий гель — стартовый гель — концентрирующий гель — разделяющий гель. [c.101] Диск-электрофорез с прослойкой из сефадекса. При изучении липопротеидов [707] была использована электрофоретическая система, состоящая из нескольких слоев акриламидного геля и сефадекса. [c.101] Метод электрофореза с изменением pH. Принцип этого метода заключается в том, что компоненты белковой смеси дважды подвергаются электрофоретическому разделению в одном и том же геле при разных pH. Этим способом удалось разделить два белка, различающихся лишь на одну единицу заряда [555]. Для первого электрофоретического разделения был выбран такой pH, при котором двигался лишь один компонент, тогда как другой оставался на старте. Затем pH изменили, заменив прежний буфер на новый, в результате чего второй компонент также приобрел заряд и электрофоретическую подвижность, Аналогичная методика была использована при изучении белковых комплексов [640]. [c.101] Вернуться к основной статье