Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

МЕТОДИКА АНАЛИТИЧЕСКОГО ДИСКРЕТНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.302]

Рис. 12.29. Аналитическое разделение белков и полипептидов методом дискретного электрофореза в колонках с полиакриламидным гелем.

Другим эффективным денатурирующим агентом является деионизованный формамид. Если РНК, растворенные в 98%-ном формамиде, подвергнуть электрофорезу в низкопроцентных полиакриламидных гелях, также содержащих 98%-ный формамид, то подвижность РНК будет определяться размерами их молекул [89, 90]. С помощью этого метода было осуществлено как аналитическое, так и препаративное разделение многих матричных и рибосомальных РНК [78] (рис. 10.7). [c.179]

Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях [c.93]

Концентрация полиакриламидного геля зависит от молекулярных масс веществ, подлежащих разделению (табл. 2). Как правило, величина Гтах (ом. рис. 36), определенная при аналитическом электрофорезе в полиакриламидном геле, дает хорошие результаты и в опытах по препаративному разделению [232]. [c.115]

Экстрагирование сегментов геля. Наиболее простой метод препаративного электрофореза в полиакриламидном геле — это использование большого числа таких же столбиков геля, какие применяются в аналитических целях. Образец наносят на эти столбики и проводят электрофорез, после чего один из них окрашивают или проявляют каким-либо иным способом. Зону, [c.117]

Электрофорез в полиакриламидном геле. С помощью аналитического электрофореза в присутствии 8 М мочевины идентифицируют мономеры, имеющие различные отношения от- [c.43]

Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о многих клеточных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования. В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусированием он может быть использован не только для аналитических, но и для препаративных целей. [c.118]

Электрофоретический анализ смеси белков проводят с помощью гель-электрофореза или изоэлектрического фокусирования, чаще всего в полиакриламидном геле с додецилсульфатом в качестве денатурирующего агента или без него. Методика описывается в разд. 9.1. В настоящее время в продаже имеется много прекрасного оборудования начинающим можно посоветовать сразу же приобрести прибор для тонкослойного электрофореза. Пожалуй, сейчас в мире мало найдется биохимических лабораторий, в которых не было бы оборудования для аналитического гель-электрофореза. [c.12]

С помощью гель-электрофореза молекулы, имеющие в иных условиях близкие электрофоретические подвижности, разделяются по их размерам. Первоначально для этой цели использовали крахмальный гель [128], который и до сих пор применяется в аналитических целях. Однако крахмальный гель никогда не удавалось успешно использовать в препаративных масштабах. Универсальным средством для анализа белков (а теперь и нуклеиновых кислот) в биохимических лабораториях стал полиакриламидный гель [129]. Он также пригоден и для препаративного электрофореза. Поскольку этот гель, представляющий собой трехмерную сетку нитей, образующих поры разных размеров [130], обладает разной эффективной вязкостью в зависимости от размеров молекул, уравнение (5.2) для электро- [c.215]

Разделение заряженных соединений с помощью электрофореза можно проводить не только в растворе, но и в различных пористых инертных средах, таких, как крахмал, силикагель, полиакриламидный гель, смоченная фильтровальная бумага. Раствор смеси веществ обычно наносят в виде четкого пятна или зоны, а затем проводят электрофорез, добиваясь иногда полного разделения всех компонентов смеси. Этот процесс, называемый зонным электрофорезом, применяют как для аналитических, так и для препаративных целей. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия широко используют для определения молекулярных масс полипептидов (разд. 5.1.7) метод иммуноэлектрофореза рассмотрен в гл. 30. [c.163]

В полиакриламидном геле образцы разделяют на горизонтальных пластинах только при препаративном электрофорезе, а для аналитических исследований применяют цилиндрические столбики геля, поддерживаемые в вертикальном положении внутри калиброванных стеклянных трубок в специальных приборах (рис. 4.7). [c.120]

Ряд недавно опубликованных работ [30, 31, 665, 666] с применением метода электрофореза в полиакриламидном геле свидетельствует о большой перспективности этого метода. Он заслуживает самого пристального внимания вследствие его уникальности и простоты. Кроме того, не требуется дорогостоящего оборудования, такого, как аналитические и препаративные ультрацентрифуги. Можно не сомневаться, что многие виды современных исследований, осуществляемых до сих пор методом центрифугирования в градиенте плотности, будут проводиться с применением электрофореза в полиакриламидном геле. Конечно, эти современные методы фракционирования макромолекул не исключают, а взаимно дополняют друг друга. [c.190]

Гели. Агаровые, крахмальные, полиакриламидные и другие гели следует готовить непосредственно перед использованием, а это зачастую процесс, требующий времени. Свойства гелей таковы, что и адсорбция, и электроосмос, и расширение зон в результате диффузии очень незначительны. Гель-электрофорез применяется и для препаративных целей, но гораздо более широко используется как аналитический метод и особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающиеся массы. [c.122]

Полное аналитическое разрешение всех рибосомных белков достигается с помощью двумерного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Удобная система разделения была предложена Э. Кальт-шмидтом и Г. Виттманном они использовали 8%-ный полиакриламидный гель при pH 8,6 для электрофореза в первом направлении и 18%-ный гель при pH 4,6 во втором направлении. В этих условиях разделялись все белки 30S субчастицы и все белки 50S субчастицы Е. oli. Пример такого разделения белков обеих рибосомных частиц в слегка модифицированной системе дан на рис. 53 и 54. Первое направление электрофореза в рыхлом геле при нейтральном или слегка щелочном pH обеспечивает движение кислых и нейтральных белков влево, к аноду, в то время как основные белки мигрируют вправо, к катоду, разделяясь в основном по заряду. Второе направление электрофореза в плотно сшитом геле при кислом pH обеспечивает движение всех белков в одну сторону —к катоду (вниз), и в их разделение большой вклад вносит размер разделяемых компонентов (чем меньше, тем подвижнее). [c.91]

В продаже имеются приборы нескольких типов. Ниже мы описываем прибор для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле, который производит фирма Reanal (Венгрия). [c.88]

В табл. 5.2-5.4 приведены примеры получения гомогенных по данным аналитического изоэлектрофокусирования и (или) электрофореза в полиакриламидном геле эндоглюканаз (см. табл. 5.2), целлобиогидролаз (см. табл. 5.3) и целлобиаз (см. табл. 5.4) из различных микробных источников. Как видно из представленных данных, во всех случаях для получения высокоочищенного фермента требуется 4-6 стадий. Помимо упомянутой выше близости множественных форм эндоглюканаз и других компонентов комплекса по биохимическим характеристикам, сложность и трудоемкость процесса получения очищенных целлюлаз связана с большим количеством примесей белкового (ксиланазы, ламинари-назы, пектиназы, протеиназы, другие белки и ферменты) и небелкового характера. Все это приводит к тому, что для ферментов из каждого, а нередко и из одного продуцента разрабатываются оригинальные схемы очистки. [c.121]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

Обычно электрофорез осуществляют в горизонтальных или вертикальных приборах различной конструкции, основной частью которых является лоток или камера с опорной средой. Электрофорез в геле можно проводить на колонках. При этом существенное отличие от предыдущих методов заключается в том, что цосле деления каждая зона может быть нослодоватольно элюирована с колоыки. Для аналитических целей применяют также дисковый электрофорез в полиакриламидном голе. [c.20]

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим. [c.276]

Рис. 39, Схта прибора для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (фирма Shandon Southern). )—электрический провод 2 —электрод, вмонтированный в крышку 5 —верхний электродный сосуд — уплотнительное кольцо для трубки 5 — калиброванные трубки для геля 5 —электрический провод 7 —узел нижнего электрода 5 —верхний электродный сосуд из комплекта для изоэле(Ктрического фокусирования 9 — вкладыш из комплекта для изоэлектрического фокусирования —нижний электродный сосуд.

Приготовление полиакриламидного геля описано в разделе, посвященном аналитическому электрофорезу. Важмо отметить, что дегазирование раствора акриламида до добавления к нему персульфата необходимо выполнять особенно тщательно, так как наличие пузырьков в геле нарушает условия проведения электрофореза. Полимеризация геля долж на происходить при той же температуре, при которой будет проводиться разделение. Для получения узких зон нужно, чтобы поверхность геля была совершенно гладкой, поэтому воду на раствор акриламида наслаивают как можно аккуратнее. Есл же для внесения пробы используют канавку, то ее формируют при помощи специального шаблона [320]. Готовый гель выдерживают до употребления не менее 1 ч или, что еще лучше, оставляют на ночь. Для удаления несущих заряд примесей и непрореагировавших Б процессе полимеризации реактивов рекомендуется проводить в течение 1 ч преэлектрофорез. [c.117]

Поскольку гель-фильтрация дает безусловно лучшие выходы при разделении крупных пептидов, чем ионообменная хроматография, оптимальный метод расщепления белка в двухстадийном анализе (рис. 10.2) удобно выбирать на основе результатов аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС), При четком разделении полос в геле целесообразно для препаративного фракционирования пептидов применять гель-фильтрацию. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН используется также для ко1ггроля полноты процесса расщепления белка химическими реагентами. [c.349]

В настоящей главе дается общий обзор ряда методов тонкого аналитического разделения белков и гликопротендов. Все это методы двумерного разделения, которое включает два последовательных этапа, основанных на использовании разных биохимических и биофизических свойств. По крайней мере одни из этих этапов — электрофорез в полиакриламидном геле. [c.72]

Ait et al. (1977) из фильтрата культуральной жидкости анаэробных бактерий lostridium thermo ellum посредством препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получен частично очищенный целлюлазный комплекс. В аналитическом диск-электрофорезе целлюлаза характеризуется одной белковой полосой с ММ 125 000+ 10000. Однако при электрофорезе в присутствии додецилсульфата целлюлаза диссоциирует по меньшей мере на пять белковых компонентов. Авторы предположили, что целлюлаза существует в виде мультиферментного комплекса. [c.186]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология