ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Высокая разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле на вела исследователей на мысль об использовании его для очистки белков и нуклеиновых кислот в препаративных целях. Для этого были разработаны разл Ичные типы приборов и буферных систем, позволившие увеличить производительность метода без ухудшения. качества разделения. [c.113] ВОДИТ к избыточному образова н-ию тепла и потере отдельных белков, а порой и к менее эффективному разделению. Поэтому способы охлаждения приборов и элюции белков заслуживают особого внимания. [c.114] Значения pH буферных растворов следует выбирать с таким расчетом, чтобы различия в зарядах между комнонентами разделяемой омеои были максимальными. Чем больше разница между pH среды и р1 макромолекул, тем быстрее они движутся и тем уже их зоны. [c.114] используемый при электрофорезе, должен иметь как можно более низкую ионную силу (0,005—0,02), что позволяет применять высокие градиенты напряжения вдоль геля при минимальном образовании тепла. Желательно, чтобы у элюирующего буфера иошая сила была выше, чем у буфера в геле, так как это помогает до некоторой степени уменьшить разведение выходящих из геля фракций. Буферные системы для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле подробно изучены рядом авторов [322, 648]. [c.114] Напряженность поля следует поддерживать настолько высокой, насколько это возможно по условиям образования и рассеяния тепла. Джовин и др. [648] нашли, что в описанном ими приборе плотность тока 5 мА/см была вполне допустимой, так как она обеспечивала градиент напряжения 10 В/см и мощность 0,5 Вт/см. Вообще, мощность не должна. превышать 10— 12 Вт, так как в противном случае разделившиеся зоны становятся вогнутыми из-за того, что в центре геля они движутся быстрее, чем у его поверхности [1094]. В начале опыта лучше использовать небольшой ток, чтобы образец плавно вошел в гель при минимальном нагреве и конвекции (1 ч и более). Скорость движения макромолекул в процессе препаративного электрофореза должна быть ниже их скорости в аналитическом опыте [1184]. [c.114] Концентрация полиакриламидного геля зависит от молекулярных масс веществ, подлежащих разделению (табл. 2). Как правило, величина Гтах (ом. рис. 36), определенная при аналитическом электрофорезе в полиакриламидном геле, дает хорошие результаты и в опытах по препаративному разделению [232]. [c.115] Длина блока геля определяется составом пробы. При использовании гелей длиной 5—10 см обычно получается вполне удовлетворительное разделение. При слищ1Ком длинных блоках происходит разведение фракций, особенно тех, которые выходят последними. Чтобы разделить два компонента, мигрирующих близко друг к другу, рекомендуется подобрать соответствующие условия, варьируя pH, напряженность поля, скорость элюции или концентрацию геля, а не увеличивать длину столбика геля, если она уже достигает 10 см [799]. [c.115] Было отмечено [253], что концентрацию бис-акриламида следует уменьшить примерно в три раза по сравнению с той,, которая используется в аналитических гелях, так как высокое содержание бис-акриламида может привести к искажению формы зон. [c.115] Количество материала, фракционируемого в одном опыте,, зависит от площади поперечного сечения геля, температуры во время электрофореза и состава разделяемой смеси. Обычно целесообразно наносить до 10 мг белка на 1 см2 поверхности геля, но, если белки движутся слишком близко друг к другу, это количество необходимо снизить примерно до 2 мг/см [1094]. [c.115] СЯ в более холодной области. В результате неодинаковой скорости миграции отдельных участков зоны искривятся, что приведет к загрязнению разделившихся фракций компонентами лредшествующей или лоследуюихей зон. Для обеспечения надлежащего охлаждения разработано много разных устройств. Они будут детально рассмотрены ниже. [c.116] Выход белков варьирует в пределах от 30 до 90%. [c.116] Артефакты, возникающие при препаративном гель-электро-.форезе. Причиной артефактов могу Т быть рибофлавин и брои-.феноловый синий [1407], способные инактивировать ферменты, поэтому их не следует применять. Примеси, содержащиеся в используемых реактивах, часто элюируются вместе с макромолекулами. Необходимо исключить условия, приводящие к осаждению белков (например, их слишком высокая концентрация в пробе). При иоследовании ферментов нежелательно проводить очень длительный электрофорез. [c.116] Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117] Получение бел ков в препаративных количествах было осуществлено при помощи электрофореза на пластине из полиакриламидного геля [1229]. Для выявления пятен белко В тонкий слой геля-окрашивали, обнаруженные пятна вырезали и подвергали элюции. [c.118] Элюцию можно про водить путем простой диффузии с использованием соответствующего буфера [763, 1139] или 70%-ной муравьиной кислоты [1360], если необходимо исследовать аминокислотный состав выделенных белков. Недостатком этого метода является малый выход бел кав. [c.118] Янг и Янг [1474] отделили РНК от примеси растворимого акриламида, осадив ее цетилтри метила- ммонийбромидом. Обычно применяемые для этих целей осаждающие агенты оказались неприемлемыми, так как в этаноле выпадал в осадок также и акриламид, а трихлоруксусная и хлорная кислоты вызывали частичный гидролиз РНК. [c.118] Вернуться к основной статье